天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究_圖文

1、成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報Journal of Chen gdu M edical College2009Dec,4(4do i:10.3969/j.issn.1674-2257.2009.04.005#論 著#天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究李 羿1, 萬德光2, 鐘世紅1, 李 晨1(1.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,四川 成都 610083;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,四川 成都 610075=摘要> 液體發(fā)酵茯苓為采用現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)的一種新型發(fā)酵中藥。2005年版中國藥典茯苓的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚不完善。筆者在粉末顯微特征、三萜類化合物、多糖、灰分和氨基酸含量等方面,對液體發(fā)酵茯苓和天然茯苓展開研究,建立

2、其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為其質(zhì)量控制打下基礎(chǔ)。=關(guān)鍵詞> 天然茯苓; 液體發(fā)酵茯苓; 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)=中圖分類號> R931.71;R931.6 =文獻標(biāo)識碼> A =文章編號> 1674-2257(200904-0251-04Study of quality standards of natural Poria cocos and liquid ferm ented Poria cocos LI Yi 1,WA N D e -guang 2,ZH ON G Shi -hong 1,LI Chen 1(1.College of P har macy ,Chengdu Medical Co

3、llege,Cheng du 610083,China;2.College of Phar macy ,Chengdu U -niv er sity of T CM ,Cheng du 610075,China=Abstract > T he liquid fer mented Por ia cocos is a new ty pe of fer mented t raditio nal Chinese medicine pr oduced by modern fermentation techno lo gy.T he standar d of P or ia cocos is not

4、 perfect in Chinese P har macop eia (2005.W e studied t he micr oscopic char acteristics,terpeno ids,polysacchar ides,ash and amino acids content of natural Por ia co-cos and liquid fer mented P or ia cocos .T hus,the standar ds of natur al Por ia cocos and liquid fermented Por ia cocos wer e establ

5、ished,w hich pro vided a basis fo r its quality co nt ro l.=Key words > natur al P or ia cocos ;liquid fermented Po ria cocos ;quality standar d收稿日期 2009-10-15 修回日期 2009-10-28基金項目 四川省科技廳項目(2006J13-150;四川省中醫(yī)藥管理局項目(200607作者簡介 李羿(1969-,男,四川成都人,副教授,博士,研究方向:微生物發(fā)酵及中藥品種、品質(zhì)研究。E -mail:ly chen gduyah 通訊作者

6、萬德光,女,四川成都人,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:中藥品種、品質(zhì)研究。E -mail:w dg茯苓為多孔菌科真菌茯苓Por ia cocos (Schw.Wolf 的干燥菌核,為利水滲濕要藥1。茯苓可通過野生采集、人工栽培和發(fā)酵培養(yǎng)三個途徑獲得。除野生采集獲得天然茯苓外,可采用傳統(tǒng)的茯苓栽培法(固體發(fā)酵來生產(chǎn)天然茯苓2,或采用現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)來生產(chǎn)液體發(fā)酵茯苓3。天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓由于發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵方式不同,導(dǎo)致天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓(發(fā)酵中藥茯苓的代謝途徑和代謝產(chǎn)物有所差異。因此,液體發(fā)酵茯苓為一種新型發(fā)酵中藥4-6。2005年版中國藥典僅在檢查項目中對茯苓水分、總灰分和酸不溶性灰分

7、有定量要求,而對茯苓主要活性成分多糖、三萜類化合物都未有明確要求7,對液體發(fā)酵茯苓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定工作尚未開展,缺乏完善的天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),嚴(yán)重地影響了茯苓質(zhì)量的有效控制和資源的開發(fā)利用。因此,筆者在對天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓研究的基礎(chǔ)上,制定了天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為茯苓相關(guān)保健食品和藥品的開發(fā)打下基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 試驗材料天然茯苓為購于成都杏林大藥房的茯苓丁。液體發(fā)酵茯苓為經(jīng)發(fā)酵罐補料液體發(fā)酵5d 的發(fā)酵液離心干燥后所得8。酵母浸膏、蛋白胨為Ox oid 產(chǎn)品;苯酚(須重251成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報2009年12月,4(4蒸;薄層層析硅膠GF254(青島海洋化工有限

8、公司;葡萄糖、K2H PO4、M gSO4.7H2O、鹽酸、氯仿、丁醇、乙醇、丙酮、乙醚和NaOH等試劑均采用國產(chǎn)分析純。全溫振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;NBS BiofloÓ型發(fā)酵罐;Beckm an J2-H S型離心機;Sartor ius BP121S型電子天平;Leica DM 1000型顯微鏡;Lam bda35U V/VIS Spectro meter 紫外分光光度儀;ZF-90型暗箱式紫外透射儀(上海顧村電光儀器廠;氨基酸自動分析儀;灰分測定裝置;FW177型粉碎機。1.2茯苓粉末的制備將烘干的液體發(fā)酵茯苓和天然茯苓分別放入粉碎器中粉碎,過篩(篩子孔徑為0

9、.170.25L m,烘箱中60e烘干至恒重,裝入有塞瓶中,貼上標(biāo)簽,放入干燥器內(nèi)備用。1.3茯苓粉末的顯微鑒定1.3.1茯苓粉末的臨時水裝片洗凈擦干載玻片及蓋玻片。用玻璃吸管加1滴蒸餾水于載玻片中央,用鑷子取少許制備的液體發(fā)酵茯苓和天然茯苓粉末于蒸餾水中,用解剖針攪勻,再蓋上蓋玻片,注意不要產(chǎn)生氣泡,多余液體用小濾紙條吸干。1.3.2茯苓粉末的臨時水合氯醛裝片洗凈擦干載玻片及蓋玻片。用玻璃吸管加1滴水合氯醛溶液于載玻片中央,用鑷子取少許制備的液體發(fā)酵茯苓和天然茯苓粉末于液滴中,用解剖針攪勻,接著手持載玻片的一端于酒精燈上均勻加熱(注意加熱時不要使液體沸騰,以免產(chǎn)生大量的氣泡,然后離開酒精燈,

10、加1滴稀甘油充分混勻,如此加熱35次。加蓋玻片,并將多余的封藏液用小濾紙條吸干。1.3.3茯苓粉末的顯微觀察觀察菌絲團塊采用水裝片;觀察菌絲采用水合氯醛透化裝片。將制備好的液體發(fā)酵茯苓或天然茯苓樣品分別置于顯微鏡下,先用低倍鏡觀察,再換用高倍鏡觀察。1.4茯苓粉末三萜類化合物的薄層層析1.4.1樣品溶液的制備用天平稱取天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓粉末各2g,加入40m l乙醚,4e冷浸提取48h,過濾,揮發(fā)干濾液,即得棕黃色含多種茯苓三萜化合物的混合物。用0.5m l乙醚分別溶解茯苓三萜成分的混合物,得到茯苓三萜類化合物的樣品液。1.4.2薄層條件固定相:硅膠GF254-CM C-Na 板;流動相:

11、環(huán)己烷-氯仿-丙酮(7.531。1.4.3展開與檢識天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓粉末的三萜成分混合物的樣品液點樣后,上行展開約10cm,取出,揮發(fā)干溶劑,在紫外燈254nm和365 nm下檢識。1.5茯苓粉末總糖的測定用苯酚-硫酸法測定糖含量9,以葡萄糖化學(xué)對照品為對照標(biāo)準(zhǔn)品。1.6茯苓粉末水溶性多糖和堿溶性多糖的測定用電子天平分別精確稱取天然茯苓粉末和液體發(fā)酵茯苓粉末各20g,按天然茯苓粉末和液體發(fā)酵茯苓粉末中多糖的提取工藝進行茯苓多糖的提取分離10,用電子天平分別精確稱量天然茯苓粉末或液體發(fā)酵茯苓粉末水溶性和堿溶性茯苓多糖純品,計算其水溶性和堿溶性茯苓多糖的提取率。1.7茯苓粉末灰分的測定1.7

12、.1茯苓粉末總灰分的測定天然茯苓粉末和液體發(fā)酵茯苓粉末總灰分的測定按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T8306-2002.1.7.2茯苓粉末水溶性灰分的測定天然茯苓粉末和液體發(fā)酵茯苓粉末水溶性灰分的測定按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T8307-2002.1.7.3茯苓粉末酸不溶性灰分的測定天然茯苓粉末和液體發(fā)酵茯苓粉末酸不溶性灰分的測定按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T8308-2002.1.8茯苓粉末氨基酸的測定天然茯苓粉末和液體發(fā)酵茯苓粉末氨基酸的測定按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009. 124-200.2結(jié)果2.1茯苓粉末的顯微鑒定2.1.1天然茯苓的顯微鑒定天然茯苓粉末白色或灰白色,無

13、色團塊散在,呈不規(guī)則顆粒狀或末端鈍圓的分枝狀。粉末遇水合氯醛液粘化成膠凍狀,加熱團塊物漸溶化,顯露菌絲。菌絲多為無色,細長,直徑28L m,單枝或分枝(見圖1。2.1.2液體發(fā)酵茯苓的顯微鑒定發(fā)酵中藥茯苓粉末棕黃色。棕黃色團塊散在,可見無色團塊。粉末遇水合氯醛液加熱團塊物漸溶化,顯露菌絲。菌絲無色或淡黃色,細長,直徑417L m,稍彎曲,多單枝(見圖2。252李 羿,等.天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究 天然茯苓粉末和液體發(fā)酵茯苓粉末的顯微特征很相似。發(fā)酵茯苓粉末菌絲分枝較多,且菌絲較粗壯;而天然茯苓粉末分枝較少,且菌絲較細長。2.2 茯苓粉末三萜類化合物的薄層層析以天然茯苓作為對照,在環(huán)

14、己烷氯仿丙酮(7.531的流動相下,在紫外燈254nm 和365nm 兩個不同的波長下,比較了天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓薄層層析圖譜。從薄層層析圖譜分析中,發(fā)現(xiàn)通過不同培養(yǎng)方法獲得的茯苓在三萜類化合物的薄層層析圖譜有較大的相似性。同時,也發(fā)現(xiàn)液體發(fā)酵茯苓三萜類化合物種類比天然茯苓三萜類化合物種類更多(見圖3、4。2.3 茯苓粉末總糖天然茯苓粉末茯苓總糖不低于80.0%.液體發(fā)酵茯苓粉末茯苓總糖不低于40.0%.2.4 茯苓粉末水溶性多糖和堿溶性多糖2.4.1 天然茯苓粉末水溶性多糖和堿溶性多糖水溶性多糖不低于 1.5%,堿溶性多糖不低于75.0%.2.4.2 液體發(fā)酵茯苓粉末水溶性多糖和堿溶性多糖

15、 水溶性多糖不低于5.0%,堿溶性多糖不低于15.0%.253成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報2009年12月,4(42.5茯苓粉末灰分2.5.1茯苓粉末總灰分天然茯苓粉末總灰分不得超過4.0%;液體發(fā)酵茯苓粉末總灰分不得超過8.0%.2.5.2茯苓粉末水溶性灰分天然茯苓粉末水溶性灰分不得超過2.0%;液體發(fā)酵茯苓粉末水溶性灰分不得超過2.0%.2.5.3茯苓粉末酸不溶性灰分天然茯苓粉末酸不溶性灰分不得超過2.0%;液體發(fā)酵茯苓粉末酸不溶性灰分不得超過2.0%.2.6茯苓粉末氨基酸天然茯苓粉末氨基酸總量不低于1.0%;液體發(fā)酵茯苓粉末氨基酸總量不低于20.0%.3討論天然茯苓粉末和液體發(fā)酵茯苓粉末在顯微特征、三

16、萜類化合物、多糖、灰分和氨基酸含量等方面均存在較大的差異。其主要原因可能是由于生產(chǎn)天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)方式不同,使天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓在代謝方式和代謝產(chǎn)物方面產(chǎn)生較大的差異,從而最終使其在顯微特征、三萜類化合物、多糖、灰分和氨基酸含量等方面均產(chǎn)生較大的差異。因此,筆者根據(jù)天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓各自顯微特征和所含化合物成分,制定了各自的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。通過對天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓所含三萜類化合物僅通過薄層層析進行了比較,尚未進行含量測定。另外,未對天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓中微量元素的種類和含量進行研究。今后,將在上述方面進一步展開天然茯苓與液體發(fā)酵茯苓的研究。隨著對天然茯苓和液

17、體發(fā)酵茯苓研究的深入,將建立更加完善的天然茯苓與液體發(fā)酵茯苓的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),以推動天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓的開發(fā)利用。參考文獻1王寧.茯苓的本草學(xué)研究J.中醫(yī)文獻雜志,2007,25(3:23-25.2蔡丹鳳,王雪英,林佩瑛,等.松樹蔸栽培茯苓新技術(shù)J.中國食用菌,2007,26(5:29-31.3王謙,冀宏,丁萬杰,等.茯苓的發(fā)酵研究及其動物免疫學(xué)觀察J.中國食用菌,2002,21(2:41-42.4莊毅.中國藥用真菌概況J.中國食用菌,2001,20(2:3-5.5王興紅,李祺德,曹秋娥.微生物發(fā)酵中藥應(yīng)成為中藥研究的新內(nèi)容J.中草藥,2001,32(3:267-268.6李羿,劉忠榮,吳洽慶,等.發(fā)酵中藥拓展