植物內(nèi)生菌DNA提取方法(共3頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上在提取植物內(nèi)生菌之前，植物需要表面滅菌，其具體操作為將植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉溶液中1 min，再將植物浸泡在70%酒精中1 min，然后用硫代硫酸鹽/Ringers（林格氏液）清洗3次，每.次1 min。根和莖（土表面以上1 cm處）都要滅菌處理，將根莖切成片狀。為了更好地分析細(xì)菌的位置，滅菌后莖表皮撕下，莖內(nèi)部按照之前的方法滅菌。表皮組織和根最后一次淋洗液中的細(xì)胞都用來(lái)提取DNA。植物不同組織的內(nèi)生菌群落DNA提取通過(guò)直接研磨植物組織，步驟為溶解、提取和純化步驟（方案一），或者在DNA提取前從片狀植物組織中淋洗出細(xì)胞（

2、方案二）。東南景天表面滅菌方法：整株植物用自來(lái)水沖洗30 min，用蒸餾水洗3次，每次3 min。用吸水紙吸去植物表面水分，用無(wú)菌剪刀在根基部將根系剪下，與植物地上部分開(kāi)。將根系用70 %酒精浸泡2 min，無(wú)菌水洗3次，3 % NaClO浸泡2次，每次1 min，然后用無(wú)菌水沖洗3次，每次2 min，最后一次清洗液涂LB平板。1. 將2 g左右消毒后植物組織于無(wú)菌研缽中，加5 mL磷酸鈉緩沖液（19.9 g Na2HPO4·H2O，1.27 g NaH2PO4·2H2O，H2O 定容到1 L）研磨至勻漿。2. 將植物勻漿轉(zhuǎn)移至50 mL無(wú)菌離心管中，搖床200 rpm振蕩

3、1-2 h，使細(xì)菌細(xì)胞盡可能的從植物組織中釋放出來(lái)。3. 取4 mL懸液于新的無(wú)菌離心管中，12 000×g離心10 min收集菌體細(xì)胞。4. 棄上清，將收集的菌體細(xì)胞重新溶于550L 1×TE buffer（Tris-EDTA；pH8）中加入10 mg mL-1溶菌酶10L，37水浴1-4h。5. 加入50L 20% SDS和8L 20 mg mL-1蛋白酶K，混勻，65水浴3h，期間輕輕上下顛倒混勻數(shù)次。6. 加入200L 5 M NaCl，渦旋振蕩15 s，12000×g離心10 min。7取上清液，并向上清液中加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1），徹底混勻

4、，12000×g離心10 min。8. 上清液轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌離心管中，重復(fù)步驟7一次。9. 上清液轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌離心管中，加入0.6倍體積（0.6 vol）的冰冷的異丙醇，4放置1 h。10. 4，12000×g離心10 min，棄上清。11. 沉淀用70 %冰乙醇清洗，離心，棄上清。12. DNA沉淀室溫風(fēng)干后，用無(wú)菌超純水溶解。13. DNA純化采用TIANquick Midi Purification Kit。微生物16S rRNA基因 V5-V6-V7區(qū)域擴(kuò)增引物：799F2：GATGG CCATT ACGGC CNNNN NN1193R：ACGCA TCCCC A

5、CCTT CCTC用含10 % SDS提取緩沖液(NaP緩沖液)重新懸浮細(xì)胞團(tuán)塊。用直徑0.11mm的玻璃珠珠打操作50 s，以溶解細(xì)胞。用苯酚-Tris (pH 8)溶液和氯仿/異戊醇提取，用0.6 vol的異丙醇和0.5 mol/L NaCl通過(guò)沉淀再次獲得DNA。用70 %的乙醇洗滌細(xì)胞團(tuán)塊，真空干燥，再溶解在50l的超純水中。原始DNA提取物用Glassmilk purification kit (Bio101, La Jolla, CA)進(jìn)一步純化。所需試劑：Na2HPO4·H2O，NaH2PO4·2H2O，10 % SDS（十二烷基硫酸鈉），Tris飽和酚，氯仿

6、/異戊醇（體積比24:1混合），異丙醇，0.5 mol/L NaCl，70 %乙醇。苯酚、氯仿、異戊醇在DNA提取時(shí)的作用抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，怎樣使用酚與氯仿較好？酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開(kāi)。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約1015的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中

7、的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA。所以在抽提過(guò)程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合（1:1）使用。 為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戊酵？在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過(guò)程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把

8、一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定Tris平衡苯酚的配制方法        1. 使用原料：大多數(shù)市售液化苯酚是清亮無(wú)色的，無(wú)需重便可用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。但有些液化苯酚呈粉紅色或黃色，應(yīng)避免使用。同時(shí)也應(yīng)避免使用結(jié)晶苯酚，結(jié)晶苯酚必須在160對(duì)其進(jìn)行重除去諸如醌等氧化產(chǎn)物，這些氧化產(chǎn)物可引起磷酸二酯鍵的斷裂或?qū)е翿NA和DNA的交聯(lián)等。因此，苯酚的質(zhì)量對(duì)DNA、RNA的提取極為重要，我們推薦使用高質(zhì)量的苯酚進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。  

9、60;      2. 操作注意：苯酚腐蝕性極強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套及防護(hù)鏡等。所有操作均應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，與苯酚接觸過(guò)的皮膚部位應(yīng)用大量水清洗，并用肥皂和水洗滌，忌用乙醇。        3. 苯酚平衡：因?yàn)樵谒嵝詐H條件下DNA分配于有機(jī)相，因此使用苯酚前必須對(duì)苯酚進(jìn)行平衡使其pH值達(dá)到7.8以上，苯酚平衡操作方法如下：           液化苯酚應(yīng)貯存于-20，此時(shí)的苯酚呈現(xiàn)結(jié)晶狀態(tài)。從冰柜中取出的苯酚首先在室溫下放置使其達(dá)

10、到室溫，然后在68中使苯酚充分溶解。           加入羥基喹啉（8-Quinolinol）至終濃度0.1。該化合物是一種還原劑、RNA酶的不完全抑制劑及金屬離子的弱螯合劑，同時(shí)因其呈黃色。有助于方便識(shí)別有機(jī)相。           加入等體積的1M -HCl（pH8.0），使用磁力攪拌15分鐘，靜置使其充分分層后，除去上層水相。            重復(fù)操作步驟。           加入等體積的0.1M -HCl（pH8.0），使用磁力攪拌15分鐘，靜置使其充分分層后，除去上層水相。            重復(fù)操作步驟，稍微殘留部分上層水相。           使用pH確認(rèn)有機(jī)相的pH值大于7.8。