細(xì)胞庫建立標(biāo)準(zhǔn)

1、細(xì)胞庫建立概況一、對(duì)細(xì)胞庫細(xì)胞基質(zhì)總的要求（一）細(xì)胞系/株歷史資料1 .細(xì)胞系/株來源資料應(yīng)具有細(xì)胞系 /株來源的相關(guān)資料，如細(xì)胞系/株制備機(jī)構(gòu)的名稱，細(xì)胞系/株來 源的種屬、年齡、性別和健康狀況的資料 。這些資料最好從細(xì)胞來源實(shí)驗(yàn)室獲得，也可引用正式發(fā)表文獻(xiàn)。人源細(xì)胞系/株須具有細(xì)胞系 /株的組織或器官來源、種族及地域來源、年齡、性 別及生理狀況的相關(guān)資料。動(dòng)物來源的細(xì)胞系 /株須具有動(dòng)物種屬、種系、飼養(yǎng)條件、組織或器官來源、地域來源、年齡、性別、病原體檢測結(jié)果及供體的一般生理狀況的相關(guān)資 料。2 .細(xì)胞系/株培養(yǎng)歷史的資料應(yīng)具有細(xì)胞分離方法、細(xì)胞體外培養(yǎng)過程及建立細(xì)胞系/株過程的相關(guān)資料，

2、包括所使用的物理、化學(xué)或生物學(xué)手段，是否有外源添加序列，以及細(xì)胞生長特征、生長液成 分、選擇細(xì)胞所進(jìn)行的任何遺傳操作或選擇方法等。同時(shí)還應(yīng)具有細(xì)胞鑒別、檢定、內(nèi)源及外源因子檢測結(jié)果的相關(guān)資料 。應(yīng)提供細(xì)胞培養(yǎng)液的詳細(xì)成分。如使用人或動(dòng)物源成分，如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其他生物學(xué)活性的物質(zhì)，應(yīng)具有這些成分的來源、制備方法、質(zhì)量控制、檢測結(jié)果和 質(zhì)量保證的相關(guān)資料O（二）細(xì)胞庫的建立細(xì)胞庫的建立可為生物制品的生產(chǎn)提供已標(biāo)定好的、細(xì)胞質(zhì)量相同的及能持續(xù)穩(wěn)定傳代的細(xì)胞種子。1 .原材料的選擇建立細(xì)胞庫的各種類型細(xì)胞的供體均應(yīng)符合細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定中相關(guān)規(guī)定。神經(jīng)系統(tǒng)來源的細(xì)胞不得用于生物制品生產(chǎn)。培

3、養(yǎng)細(xì)胞用牛血清應(yīng)來源于無牛腦海綿體腦病流行地區(qū)的健康牛群，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合規(guī)定（附錄XIII D）。不得使用人血清作為細(xì)胞培養(yǎng)液。如需使用人血白蛋白，則須使用有批準(zhǔn)文號(hào)的合格制品。消化細(xì)胞用胰蛋白酶應(yīng)進(jìn)行檢測，證明其無細(xì)菌、真菌、支原體或病毒污染。特別應(yīng)檢測胰蛋白酶來源的動(dòng)物可能攜帶的病毒，如細(xì)小病毒等。用于生物制品生產(chǎn)的培養(yǎng)物中不得使用青霉素或伊內(nèi)酰胺（伊Lactam）類抗生素。2 .細(xì)胞培養(yǎng)操作的要求細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)人員應(yīng)定期檢查身體 。在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)不得進(jìn)行非生產(chǎn)制品用細(xì)胞或微生物的操作；在同一工作日進(jìn)行細(xì)胞操作前，不得操作或接觸有感染性的微生物或動(dòng)物3 .建立細(xì)胞庫細(xì)胞庫為三級(jí)管理，即原始細(xì)胞

4、庫、主細(xì)胞庫及工作細(xì)胞庫。如為引進(jìn)的細(xì)胞，可采用主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫組成的二級(jí)細(xì)胞庫管理一級(jí)庫，但須得到國務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門的批準(zhǔn)(1)原始細(xì)胞庫(PCB)由一個(gè)原始細(xì)胞群體發(fā)展成傳代穩(wěn)定的細(xì)胞群體 群體，通過檢定證明適用于生物制品生產(chǎn)或檢定 的細(xì)胞懸液，定量均勻分裝于安甑，于液氮或一 立主細(xì)胞庫用。在某些特殊情況下，也可使用主細(xì)胞庫O,或經(jīng)過克隆培養(yǎng)而形成的均一細(xì)胞。在特定條件下，將一定數(shù)量、成分均一130 c以下凍存，即為原始細(xì)胞庫，供建(2)主細(xì)胞庫(MCB)取原始細(xì)胞庫細(xì)胞，通過一定方式進(jìn)行傳代、增殖后均勻混合成一批，定量分裝，保 存于液氮或一 130 c以下。這些細(xì)胞必須按其特定的

5、質(zhì)控要求進(jìn)行全面檢定，全部合格后即為主細(xì)胞庫，供建立工作細(xì)胞庫用。(3)工作細(xì)胞庫(WCB)工作細(xì)胞庫的細(xì)胞由 MCB細(xì)胞傳代擴(kuò)增制成。由MCB的細(xì)胞經(jīng)傳代增殖，達(dá)到一定代次水平的細(xì)胞，合并后制成一批均質(zhì)細(xì)胞懸液，定量分裝于安甑，保存于液氮或一130 c以下備用，即為工作細(xì)胞庫。凍存時(shí)細(xì)胞的傳代水平須確保細(xì)胞復(fù)蘇后傳代增殖的細(xì)胞數(shù)量能滿足生產(chǎn)一批或一個(gè)亞批制品。復(fù)蘇后的傳代的水平應(yīng)不超過批準(zhǔn)的該細(xì)胞用于生產(chǎn)的最高限定代次。所制備的 WCB必須經(jīng)檢定合格，方可用于生產(chǎn)。4 .細(xì)胞庫的管理每種細(xì)胞庫均應(yīng)分別建立臺(tái)賬 ，記錄放置位置、容器編號(hào)、分裝及貯存安甑數(shù)量，取用 記錄等。細(xì)胞庫中的每 支細(xì)胞安

6、甑均應(yīng)注明細(xì)胞系 /株名、代次、安甑號(hào)、凍存日期， 貯存容器的編號(hào)等。凍存的細(xì)胞存活率應(yīng)在90%以上。凍存后的細(xì)胞，應(yīng)至少做一次復(fù)蘇培養(yǎng)并連續(xù)傳代至衰老期，檢查不同傳代水平的細(xì)胞生長情況。主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫分別存放。非生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)與生產(chǎn)用細(xì)胞嚴(yán)格分開存放。（三）細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定細(xì)胞檢定主要包括以下幾個(gè)方面：細(xì)胞鑒別、外源因子污染和內(nèi)源因子的檢測 、致瘤性檢測等。必要時(shí)還須進(jìn)行細(xì)胞染色體核型檢查。這些檢測內(nèi)容對(duì)于 MCB細(xì)胞和 WCB細(xì) 胞均適用。建立細(xì)胞庫的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)至少進(jìn)行一次MCB細(xì)胞的全面檢定，檢定應(yīng)包括：細(xì)胞鑒別試驗(yàn)，細(xì)菌、真菌檢查，支原體檢查，外源病毒因子檢查等。每次建立 WCB后，

7、均應(yīng)按規(guī)定 項(xiàng)目進(jìn)行檢定1 .細(xì)胞鑒別試驗(yàn)新建細(xì)胞系/株、細(xì)胞庫（MCB和WCB）和生產(chǎn)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行鑒別試驗(yàn) ，以確認(rèn) 為本細(xì)胞，無其他細(xì)胞的交叉污染。細(xì)胞鑒別試驗(yàn)方法有多種，包括細(xì)胞遺傳檢測（如特征 染色體標(biāo)志卜遺傳標(biāo)志檢測（如DNA指紋圖譜、STR圖譜、基因組二核昔重復(fù)序列 卜免疫 學(xué)檢測（如組織相容性抗原、種特異性抗血清）和生物化學(xué)鑒別法（如同工酶試驗(yàn)）等?？蛇x其中一種或幾種方法 ，但均須經(jīng)國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可。細(xì)胞表型特征與遺傳學(xué)特征相結(jié)合來判斷，更有利于細(xì)胞鑒別。2 .細(xì)菌、真菌檢查取細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品3 .支原體檢查取細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品，應(yīng)為陰性。4.細(xì)胞內(nèi)、外源病毒因子檢查

8、應(yīng)注意檢查細(xì)胞系/株中是否有細(xì)胞來源物種中潛在的可傳染的病毒 ，以及由于操作 帶入的外源性病毒。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行病毒檢查的種類及方法 ，須根據(jù)細(xì)胞的種屬來源、組織來 源及細(xì)胞特性決定。（1）細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（簡稱血吸附試驗(yàn)）取混合瓶細(xì)胞樣品，接種至少 6個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長成單層后換維持 液，持續(xù)培養(yǎng)兩周。每日鏡檢細(xì)胞，細(xì)胞應(yīng)保持正常形態(tài)特征 。細(xì)胞至少培養(yǎng)14天后，分別取1/3細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，用02%0.5%豚鼠紅細(xì) 胞和雞紅細(xì)胞混合懸液進(jìn)行血吸附試驗(yàn) 。加入紅細(xì)胞后置 48 c 30分鐘，然后置20 25 c 30分鐘，分別進(jìn)行鏡檢，觀察紅細(xì)胞吸附情況，結(jié)果應(yīng)均為陰性。

9、新鮮紅細(xì)胞在28c保存不得超過7天，且溶液中不應(yīng)含有鈣離子或鎂離子。（2）不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子自MCB或WCB來源的細(xì)胞，分別接種下列三種單層細(xì)胞，包括猴源細(xì)胞、人源二倍 體細(xì)胞和同種不同批的細(xì)胞 。每種單層細(xì)胞接種至少10000000個(gè)活細(xì)胞或裂解細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液，每種細(xì)胞至少接種 2瓶。接種樣品量應(yīng)占維持液的1/4以上，培養(yǎng)至少14天。取培養(yǎng)7天的上清液各一瓶，分別接種于同種細(xì)胞培養(yǎng) ，盲傳一代，繼續(xù)培養(yǎng)7天， 觀察細(xì)胞病變并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)。若待檢細(xì)胞已知可支持人巨細(xì)胞病毒（CMV）的生長，則應(yīng)在接種人二倍體細(xì)胞后至少觀察28天，應(yīng)無細(xì)胞病變。同時(shí)，應(yīng)進(jìn)行血吸

10、附病毒檢測，應(yīng)為陰性。（3）接種動(dòng)物和雞胚法檢測病毒因子MCB細(xì)胞或 WCB細(xì)胞以及增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次的細(xì)胞，須采用動(dòng)物體內(nèi)接種法進(jìn)行外源病毒因子檢測 。選用乳鼠、成鼠和雞胚（兩組不同日齡）共1t 4組， 按表1所列方法進(jìn)行試驗(yàn)和觀察。如試驗(yàn)到期有80 %以上動(dòng)物或雞胚健存，此試驗(yàn)成立， 結(jié)合其他檢測確定結(jié)果。對(duì)于新建細(xì)胞系 /株，還應(yīng)接種豚鼠和家兔（見表1）。豚鼠主要用于檢查細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分 枝桿菌，在注射前觀察 4周，結(jié)核菌素試驗(yàn)為陰性者方可用于試驗(yàn)。家兔主要用于檢測猴來源細(xì)胞中是否存在 B病毒污染，也可用兔腎細(xì)胞培養(yǎng)法代替 。動(dòng)物組要求數(shù)量接種途徑細(xì)胞濃度/個(gè)活細(xì)胞ml派接

11、種細(xì)胞液量 /ml只-觀察天數(shù)結(jié)果判定乳鼠24小時(shí)內(nèi)10（2 窩）腦內(nèi)腹腔10 7O. 01O. 121應(yīng)健存成鼠1520g10腦內(nèi)腹腔2X10 60.03O. 521應(yīng)健存雞胚911日齡10尿囊腔5X106O. 234 尿液血凝試驗(yàn)陰性雞胚56日齡10卵更襄2X106O. 55應(yīng)存活豚鼠350500g5腹腔4X10 55. O42 應(yīng) 健存，解剖無結(jié)核病變家兔1.52.5kg5皮卜皮內(nèi)2X10s9.0O. 1 X1021 無異常，健存(4)逆轉(zhuǎn)錄病毒及其他內(nèi)源性病毒或病毒核酸的檢測可采用下列方法對(duì) MCB細(xì)胞或WCB細(xì)胞以及增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制次的細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測 。逆轉(zhuǎn)

12、錄酶活性測定采用敏感的方法，如產(chǎn)品增強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定法(PERT威其他檢測逆轉(zhuǎn)錄酶的方法，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中逆轉(zhuǎn)錄酶活性。透射電鏡檢查收集待檢細(xì)胞 ，低速離心后，棄上清，沉淀中應(yīng)含有1X10 7個(gè)細(xì)胞，且細(xì)胞存活率應(yīng)不低于99%。在沉淀中加入固定劑，于4 c保存或直接包埋后制備超薄切片，置于銅網(wǎng)上染色后透射電鏡觀察。感染性試驗(yàn)將待檢細(xì)胞感染逆轉(zhuǎn)錄病毒敏感細(xì)胞，培養(yǎng)后檢測。根據(jù)待檢細(xì)胞的種屬來源，須使用不同的敏感細(xì)胞進(jìn)行感染性試驗(yàn)。這三種方法具有不同的檢測特性及靈敏度，因此應(yīng)采用不同的方法聯(lián)合檢測。若逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測陽性時(shí)，建議進(jìn)行透射電鏡檢查或感染性試驗(yàn)，以確證是否存在感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆

13、粒。小鼠來源和其他嚙齒類來源的細(xì)胞系或其雜交瘤細(xì)胞系有可能攜帶潛在的逆轉(zhuǎn)錄病毒。因此，對(duì)于人一鼠雜交瘤細(xì)胞系則應(yīng)進(jìn)行特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測。如用于單克隆抗體生產(chǎn)的小鼠細(xì)胞系，則可不檢測特異性的逆轉(zhuǎn)錄病毒，但在生產(chǎn)工藝中應(yīng)增加病毒滅活程序。(5)特殊外源病毒因子的檢測應(yīng)對(duì)MCB細(xì)胞或 WCB細(xì)胞進(jìn)行特殊病毒的檢測 。檢測病毒的種類應(yīng)根據(jù)細(xì)胞系 /株 種屬、組織來源等確定。如鼠源的細(xì)胞系，可采用小鼠、大鼠和倉鼠抗體產(chǎn)生試驗(yàn)，檢測其種特異病毒。人源的細(xì)胞系 /株，則應(yīng)檢測如人鼻咽癌病毒、人巨細(xì)胞病毒、人逆轉(zhuǎn)錄病毒、人乙 型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。在某些情況下，也可能進(jìn)行轉(zhuǎn)化病毒的檢測 ，如人乳頭瘤

14、病毒、腺病毒及人單純皰疹病毒。這些病毒的檢測可采用適當(dāng)?shù)捏w外檢測技術(shù) 。5.致瘤性檢查某些傳代細(xì)胞系已證明具有致瘤性，如來源于嚙齒類的細(xì)胞系BHK21、CHO、C127 胞等，或細(xì)胞類型屬致瘤性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞，則可不必做致瘤性檢查。某些傳代細(xì)胞系已證明在一定代次內(nèi)不具有致瘤性，而超過某代次則具有致瘤性，如Vero細(xì)胞，則必須進(jìn)行致瘤性檢查 。人上皮細(xì)胞系、人二倍體細(xì)胞株及所有用于活病毒疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系/株應(yīng)進(jìn)行致瘤性檢查。另外，新建細(xì)胞系/株必須進(jìn)行致瘤性檢查 。在某些情況下，用于人體細(xì)胞治療及基因治療的細(xì)胞也須進(jìn)行致瘤性檢查。將來源于MCB細(xì)胞或WCB細(xì)胞的增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限

15、制代次，再進(jìn)行致瘤性試驗(yàn)。下述兩種致腫瘤性試驗(yàn)方法可任選其一：裸鼠至少10只，將細(xì)胞懸浮于適量無血清培養(yǎng)基中，使細(xì)胞濃度為每lml含5X10 7個(gè)細(xì)胞，每只裸鼠皮下注射或肌內(nèi)注射 O. 2ml ;同時(shí)用Hela細(xì)胞或HeP-2細(xì)胞設(shè)立陽性 對(duì)照，陽性對(duì)照組至少10只，每只注射0. 2ml含10 6個(gè)細(xì)胞；可用人二倍體細(xì)胞株作為 陰性對(duì)照，陰性對(duì)照組至少10只，每只注射0. 2ml含10 7個(gè)細(xì)胞。新生小鼠（35日齡），8lOg小鼠10只，在出生后第0天、2天、7天和第14天， 分別用O. 1ml抗胸腺血清（ATS）或球蛋白處理，然后同上每只皮下接種10 7個(gè)活細(xì)胞。并設(shè)立陽性對(duì)照組，對(duì)照組至少

16、接種10只。結(jié)果判定：定期觀察并觸摸注射部位有無結(jié)節(jié)形成，且形成的任何結(jié)節(jié)均應(yīng)進(jìn)行雙向測量并記錄。陽性對(duì)照組至少有 9只有進(jìn)行性腫瘤生長時(shí)，試驗(yàn)視為有效。如試驗(yàn)組動(dòng)物有進(jìn)行性生長的結(jié)節(jié)或可疑病灶，應(yīng)觀察至少12周；若出現(xiàn)的結(jié)節(jié) 在觀察期內(nèi)開始消退，則應(yīng)在結(jié)節(jié)完全消退前，處死動(dòng)物并進(jìn)行解剖做病理及組織學(xué)檢 查。未發(fā)生結(jié)節(jié)的動(dòng)物，半數(shù)動(dòng)物應(yīng)觀察21天，剖檢，另外半數(shù)動(dòng)物應(yīng)觀察 12周，進(jìn) 行病理檢查，剖檢接種部位，觀察各淋巴結(jié)和各器官有無結(jié)節(jié)形成，如有懷疑，進(jìn)行病理組織檢查，不應(yīng)有轉(zhuǎn)移瘤形成。除上述體內(nèi)法外，也可采用軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)或器官培養(yǎng)試驗(yàn)等體外法檢測，特別適用于低代次時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)無致瘤性

17、的傳代細(xì)胞系。（四）生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)用原材料的選擇和細(xì)胞操作環(huán)境，應(yīng)符合本規(guī)程一、（二）細(xì)胞庫的建立中有關(guān)規(guī)定。從凍存的WCB中取出一支或多支安甑，混合后培養(yǎng)，傳至一定代次后供生產(chǎn)用。其代 次不得超過該細(xì)胞用于生產(chǎn)的最高限定代次。從WCB取出的細(xì)胞種子增殖的細(xì)胞不得再回凍保存或再用于生產(chǎn)。體外培養(yǎng)細(xì)胞齡的計(jì)算二倍體細(xì)胞齡以細(xì)胞群體倍增（Population Doubling）計(jì)算，以每個(gè)培養(yǎng)容器細(xì)胞群體細(xì)胞數(shù)為基礎(chǔ)，每增加一倍作為一世代，即一瓶細(xì)胞傳二瓶（1 : 2分種率），再長滿瓶為一 世代；一瓶傳四瓶（1 : 4）為二世代；一瓶傳八瓶（1 : 8）則為三世代。生產(chǎn)用細(xì)胞齡限制在細(xì) 胞壽命

18、期限的前2/3內(nèi)。傳代細(xì)胞系則以一定稀釋倍數(shù)進(jìn)行傳代，每傳一次為一代。二、連續(xù)傳代細(xì)胞系的特殊要求傳代細(xì)胞系一般是由人或動(dòng)物腫瘤組織或正常組織傳代或轉(zhuǎn)化而來，可懸浮培養(yǎng)或采用載體培養(yǎng)，能大規(guī)模生產(chǎn)。這些細(xì)胞可無限傳代，但到一定代次后，致瘤性會(huì)增強(qiáng)。所以對(duì)生產(chǎn)用傳代細(xì)胞系應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格檢查。應(yīng)按本規(guī)程一、（三）細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定的規(guī)定進(jìn)行細(xì)胞庫的檢查。對(duì)生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)的要求如下：1 .用于生產(chǎn)的細(xì)胞代次用于生產(chǎn)的傳代細(xì)胞系，代次都有一定限制。用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞最高限定代次，須經(jīng)批準(zhǔn)。2 .在生產(chǎn)末期進(jìn)行外源病毒因子檢測對(duì)手病毒類制品，茬生產(chǎn)末期，對(duì)照細(xì)胞應(yīng)按本規(guī)程一、（三）4. （1）細(xì)胞形態(tài)

19、觀察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)規(guī)定進(jìn)行血吸附病毒檢查。對(duì)于在不同時(shí)間收集合并的培養(yǎng)物，應(yīng)在每次 收集時(shí)檢測對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)物。三、人二倍體細(xì)胞株的特殊要求新建的人二倍體細(xì)胞株必須具有以下資料：建立細(xì)胞株所用胎兒的胎齡和性別、終止妊娠的原因、所用胎兒父母的年齡、職業(yè)及健康良好的證明（醫(yī)師出具的健康狀態(tài)良好 、無 潛在性傳染病和遺傳性疾患等證明），以及胎兒父系及母系三代應(yīng)無明顯遺傳缺陷疾病歷史 的書面調(diào)查資料。人二倍體細(xì)胞株應(yīng)在傳代過程的早期，選擇適當(dāng)世代水平（28世代）增殖出大量細(xì)胞，定量分裝后，置液氮中或一 130 c下凍存，供建立PCB之用，待全部檢定合格后，即可正式定為PCB,供制備MCB用。1 .染色

20、體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn)新建人二倍體細(xì)胞株及其細(xì)胞庫必須進(jìn)行染色體檢查。對(duì)于已建株的人二倍體細(xì)胞株，如WI-38、MRC-5、2BS、KMB17等，在建立MCB時(shí)可不必進(jìn)行細(xì)胞染色體檢查。但如對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了遺傳修飾，則須按新建細(xì)胞株進(jìn)行染色體檢查。(1)染色體檢查新細(xì)胞建株過程中，每812世代應(yīng)做一次染色體檢查，一株細(xì)胞整個(gè)生命期內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)過程中，至少應(yīng)有4次染色體檢查結(jié)果。每次染色體檢查，應(yīng)至少隨機(jī)取1000個(gè)分裂中期細(xì)胞，進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu) 檢查，并做記錄以備復(fù)查。其中至少選擇 50個(gè)分裂中期細(xì)胞進(jìn)行顯微照相 ，作出核型分 析，并應(yīng)粗?jǐn)?shù)500個(gè)分裂中期細(xì)胞，檢查多倍體的發(fā)生率。每次染色體檢查

21、，應(yīng)從同一世代的不同培養(yǎng)瓶中取細(xì)胞，混合后進(jìn)行再培養(yǎng)，制備染色體標(biāo)本片。染色體片應(yīng)長期保存，以備復(fù)查?？捎肎分帶或Q分帶技術(shù)檢查50個(gè)中期細(xì)胞染色體帶型，應(yīng)用照相圖片作出帶型分 析。(2)判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)1000個(gè)和500個(gè)中期細(xì)胞標(biāo)本異常率進(jìn)行檢查，合格的上限(可信限90% Poison法)如表2。表2人二倍體細(xì)胞染色體分析標(biāo)準(zhǔn)檢查細(xì)胞數(shù)1000|500 |100 |I染色單體和染色體斷裂I結(jié)構(gòu)異常I超二倍體II亞二倍體I多倍體47|26|8|17|10|2|I 8 I 5|2180|90|18|30|17|4亞二倍體如超過上限，可能因制片過程中人為丟失染色體，應(yīng)選同批號(hào)標(biāo)本重新計(jì)數(shù)。一個(gè)中期細(xì)胞

22、內(nèi)超過53條染色體，即為一個(gè)多倍體。2 .無菌檢查每812世代細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行無菌檢查（附錄XU A）。3 .支原體檢查每812世代細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行支原體檢查（附錄XU B）。4 .病毒檢查二倍體細(xì)胞株傳代過程中，至少對(duì)2個(gè)不同世代水平進(jìn)行病毒包含體、乙型肝炎、丙型肝炎、EB病毒、艾滋病病毒檢查等，結(jié)果應(yīng)均為陰性。5 .致瘤性檢查每812世代應(yīng)做一次致瘤性檢查(方法見本規(guī)程一、(三)5.致瘤性檢查),結(jié)果應(yīng)無致瘤性。6 .生產(chǎn)過程細(xì)胞培養(yǎng)物檢查(1)染色體檢查可根據(jù)制品特性及生產(chǎn)工藝，確定是否進(jìn)行生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)物的染色體檢查。通常，含有活細(xì)胞的制品或純度不足的制品，應(yīng)對(duì)所用細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)

23、行染色體檢查及評(píng)價(jià)(見本規(guī)程三、1.染色體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn))。但如采用已建株的人二倍體細(xì)胞生產(chǎn)，則不要求進(jìn)行染色體核型檢查 。(2)細(xì)胞鑒別試驗(yàn)按本規(guī)程一、(三)細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定中細(xì)胞鑒別試驗(yàn)進(jìn)行。(3)無菌檢查按附錄XU A進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。(4)支原體檢測按附錄XU B進(jìn)行，應(yīng)為陰性。(5)正常細(xì)胞外源病毒因子檢測制備病毒類制品時(shí)，于接種病毒的當(dāng)天或在連續(xù)傳代的最后一次接種病毒時(shí)，留取此批細(xì)胞的2%5%的細(xì)胞不接種病毒，換維持液作為正常細(xì)胞對(duì)照。與接種病毒的細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)，并按本規(guī)程一、(三)4. (1)細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)和(2)不 同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子”的規(guī)定進(jìn)行外

24、源病毒污染檢查四、重組細(xì)胞的特殊要求重組細(xì)胞，系通過DNA重組技術(shù)獲得的含有特定基生物制品生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程因序列的細(xì)胞系，因此重組細(xì)胞系的建立應(yīng)具有細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建方法的相關(guān)資料如細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)染、篩選、集落分離、克隆、基因擴(kuò)增及培養(yǎng)條件或培養(yǎng)液的適應(yīng)性等方面的資料。細(xì)胞庫細(xì)胞的檢查應(yīng)按本規(guī)程 一、（三）細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定”的規(guī)定進(jìn)行，但還應(yīng)進(jìn)行下述檢查：1 .細(xì)胞基質(zhì)的穩(wěn)定性生產(chǎn)者須具有該細(xì)胞系用于生產(chǎn)的目的基因的穩(wěn)定性資料，包括重組細(xì)胞系的遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達(dá)穩(wěn)定性、目的產(chǎn)品持續(xù)生產(chǎn)的穩(wěn)定性，以及一定條件下保存時(shí)細(xì)胞生 產(chǎn)目的產(chǎn)品能力的穩(wěn)定性等資料。2 .鑒別試驗(yàn)除按本規(guī)程一、（三）1.細(xì)胞鑒別試驗(yàn)進(jìn)行外，還應(yīng)通過檢測目的蛋白基因或蛋白進(jìn) 行鑒別試驗(yàn)。3 .重組細(xì)胞產(chǎn)物的外源病毒因子檢測應(yīng)按本規(guī)程一、（三）4. （1）細(xì)胞形態(tài)觀察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)和（2）不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢病毒因子”的規(guī)定對(duì)細(xì)胞裂解物或收獲液及生產(chǎn)用培養(yǎng)基進(jìn)行外源病毒因子的檢測。五、原代細(xì)胞的要求原代細(xì)胞應(yīng)來源于健康的動(dòng)物臟器組織或胚胎，包括猴腎、地鼠腎、沙鼠腎、家兔腎、狗腎或動(dòng)物的胎兒和