分子克隆操作技術(shù)注意事項

1、分子克隆操作技術(shù)注意事項引物設(shè)計1. 設(shè)計模板：基因過表達(dá)的設(shè)計模板為mRNA （根據(jù)基因名稱和樣品種屬從NCBI 查詢） , 啟動子（轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域）的設(shè)計模板為基因組 DNA 片段（根據(jù)基因名稱和種屬從 UCSC 查詢，并在 NCBI 核實序列）， DNA 甲基化分析（CpG島，根據(jù)基因名稱和種屬從 UCSC查詢，并在NCBI核實序列）;2. 設(shè)計軟件： Vector NTI 用于設(shè)計過表達(dá)引物， Vector NTI 用于設(shè)計啟動子 （轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域）克隆引物; Methprimer 用于設(shè)計 DNA 甲基化分析引物（ BSP,MSP)3. 5'和 3'端的酶切位點和保護性堿

2、基所用的載體的多克隆位點（MCS）有，所克隆的序列沒有，可以同時做雙酶切, 我們的酶庫有，價格便宜的，加了保護性堿基可以直接進行 PCR產(chǎn)物酶切的（詳 情見保護性堿基 .doc）;引物溶解1.引物的儲液濃度為100卩M,計算加入滅菌水的量;2.3.4.引物溶液應(yīng)-20 C保存;打開管蓋前，必須先12000RPM離心2min,因為引物為粉末，容易飄出；加入滅菌水溶解前，應(yīng)稍微打開管蓋即可，以免粉末飄出;5.引物使用的工作液濃度為10卩M,需要多少稀釋多少，剩余的應(yīng)丟棄;PCR1. 操作注意事項：操作前，應(yīng)熟知所用 PCR 酶的說明書，并熟知說明書標(biāo)示的 注意事項（引物、模板和酶的建議用量，變性溫

3、度及時間，延伸速度等）PCR是極為靈敏的技術(shù)，因此要決定避免交叉污染，注意冰上操作，這樣可 以提高擴增的特異性;2. 理解掌握每步操作的原理和注意事項;3. PCR實驗進行前，應(yīng)考慮以下幾個問題：引物的使用量，引物的反應(yīng)濃度一般為0.2-1卩M ;模板的用量，各種模板的建議用量參考PCR酶說明書，原則上第一次進行 PCR 反應(yīng)時，采取中間值;4. PCR常見問題及對策問題原因?qū)Σ邲]有任何條帶（“白板”）PCR體系中成分是否有 遺漏添加重新進行實驗沒有目的條帶，但有引物二聚體反應(yīng)效率過低，其中原因 可能是引物與模板的配 比不合適，不是模板加得 越多反應(yīng)效率就越高，退 火溫度過高，導(dǎo)致引物與 模板

4、無法配對調(diào)整引物與模板的配比， 一般按照PCR酶的說明 書的建議選擇合適的引 物和模板的添加量，降低 退火溫度有目的條帶，但產(chǎn)量低反應(yīng)效率低，其中原因可 能是引物與模板的配比 不合適，不是模板加得越 多反應(yīng)效率就越高，退火 溫度高，導(dǎo)致引物與模板 結(jié)合配對不穩(wěn)調(diào)整引物與模板的配比， 一般按照PCR酶的說明 書的建議選擇合適的引 物和模板的添加量，降低 退火溫度有目的條帶，但有其他雜 帶反應(yīng)特異性不咼，其中原 因可能是引物設(shè)計存在 缺陷，退火溫度較低提咼退人溫度，如果目的 帶與雜帶相距較遠(yuǎn)，產(chǎn)物 產(chǎn)量可以滿足下游實驗 需要，可不考慮重新設(shè)計 引物四、長引物退火產(chǎn)生DNA雙鏈一般通過PCR擴增所需

5、的DNA雙鏈，如果DNA雙鏈膠短（150bp以內(nèi)），這可 以通過合成互補長引物，并在引物兩側(cè)預(yù)留 酶切后的酶切位點，通過變性退火程序即可形成互補的DNA雙鏈，一般在制備shRNA編碼框，miRNA過表達(dá)或干擾編碼框時，可以采取上述策略;五、全基因合成如果通過PCR技術(shù)無法獲取目標(biāo)DNA片段，我們一般委托DNA合成公司進行全基因合成， 只需告知我們需要合成的序列， 并在序列的兩側(cè)加上克隆所需的酶 切位點，服務(wù)公司合成后將克隆至克隆載體中， 我們收到重組克隆載體 （我們自 己需要進行酶切鑒定和測序鑒定） ，需要利用預(yù)留的酶切位點亞克隆至我們的目標(biāo)載體中，然后進行酶切鑒定和測序鑒定；、.六、瓊脂凝膠

6、電泳1.2.作用：PCR產(chǎn)物鑒定，酶切產(chǎn)物鑒定，膠回收純化 PCR或酶切產(chǎn)物;3.膠濃度：一般為 1%，根據(jù)分析產(chǎn)物的大小選擇合適的膠濃度；電壓：電壓高，泳動速度快，耗時短，但產(chǎn)熱量大，容易燒膠，條帶模糊，電壓低，泳動速度慢，耗時長，但產(chǎn)熱量小，條帶清晰，應(yīng)根據(jù)實際情況選擇合適的電壓；4.電泳緩沖液： 加入電泳緩沖液的量高過膠面 1厘米以上，如果進行膠回收時， 必須使用新的電泳緩沖液液，這是為了避免污染（電泳槽和膠槽也需清洗干 凈并用超純水潤洗）和提高回收效率（舊電泳緩沖液的PH環(huán)境不利用DNA回收）；5.理解掌握每步操作的原理和注意事項；七、 酶切1.DNA 的用量： 一般使用 0.5-1u

7、g, 這樣可以保證條帶清晰，切產(chǎn)物中有目的條帶小于250b P使用考慮使用較多DNA酶切充分； 如果酶 進行酶切，否則目的條帶不清晰；2.限制性內(nèi)切酶的用量：根據(jù)酶的活性單位進行添加，一般1ul 酶含 10 個活性國際單位，可以在 1 小時內(nèi)充分酶切 1ugDNA ，一般酶的用量不能超過酶切體系的 1/10 體積，否則產(chǎn)生星活性（酶切不特異）3.酶切體系：酶切總體系一般為 20-30ul ，體系大，可以使抑制酶切的因素稀釋， 但做瓊脂糖凝膠電泳時需要配制較厚的膠，根據(jù) DNA 的濃度和純度選擇合適的酶切體系；4.緩沖液：根據(jù)限制性內(nèi)切酶廠家的要求選擇合適的緩沖液（buffer），進行雙酶切時，

8、查詢廠家提供的雙酶切反應(yīng)緩沖液表格即可;5.理解掌握每步操作的原理和注意事項；八、DNA 片段純化1.PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物，酶修飾產(chǎn)物，如需進行下一步酶學(xué)操作，必須先進行 純化回收；2.方法：膠回收純化試劑盒或 PCR 產(chǎn)物回收純化試劑盒， 膠回收純化試劑盒是 通用試劑盒，適用于所有情況， PCR 產(chǎn)物回收純化試劑盒只適用于產(chǎn)物中片段特異的情況，例如 PCR 產(chǎn)物特異，酶切產(chǎn)物大小特異，修飾酶產(chǎn)物；3.4.進行膠回收時注意紫外線照射時間勿超過 60S，否則導(dǎo)致DNA片段突變;理解掌握每步操作的原理和注意事項；九、去磷酸化1. 單酶切的載體或目的片段進行連接時， 它們各自在體內(nèi)和體外容易進行自連

9、， 為防止自連，必須利用磷酸化酶（CIP）進行去磷酸化處理；2. 理解掌握每步操作的原理和注意事項；十、 磷酸化處理1. 某些情況下，如果該片段的末端沒有磷酸基團，自連是無法發(fā)生的，如需要 對片段進行自連，則需要利用激酶進行磷酸化處理;2. 理解掌握每步操作的原理和注意事項；DNA 連接1. 載體片段與目的片段的用量： 目的片段與載體片段的摩爾比應(yīng)大于 3:1，小于10:1，載體片段與目的片段的總用量因大于 50ng 小于 200ng;2. 連接體系：總連接體系一般為10-20UI,體系小，載體片段與目的片段的碰撞幾率提高，從而提高連接效率，在各種條件滿足的條件下，盡量進行小體系連接；3. 連

10、接時間和連接溫度： 參考連接酶的操作指南， 如果片段的兩端均為粘末端， 可進行室溫短時間連接，如果片段的兩端有一端或兩端為平末端，應(yīng)進行低溫長時間連接；4. 理解掌握每步操作的原理和注意事項；十二、 感受態(tài)細(xì)胞制備1. 感受態(tài)細(xì)胞種類：熱擊感受態(tài)細(xì)胞（ CaCl2 法），電擊感受態(tài)細(xì)胞（ 10%甘油 法）;2. 細(xì)菌轉(zhuǎn)接：復(fù)蘇的細(xì)菌切勿培養(yǎng)超過16h，否則細(xì)菌太老了，活力極差；轉(zhuǎn)接比例應(yīng)控制在 1:500-1:1000，這樣保證后續(xù)生長的細(xì)菌的活力，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)體積，根據(jù)實際需要決定，但培養(yǎng)體積不可超過培養(yǎng)器皿總體積的1/3；3. 細(xì)菌生長條件：嚴(yán)格按照目的細(xì)菌的生長溫度，保證振蕩速度不低于225

11、RPM,這樣可以保證換氧充分，生長旺盛;4. 細(xì)菌生長密度：如果進行熱擊感受態(tài)細(xì)胞制備， 菌液的 OD600 值應(yīng)為 0.2-0.3， 肉眼觀察到現(xiàn)象為云霧狀， 如果進行電擊感受態(tài)細(xì)胞制備， 菌液的 OD600 值應(yīng)為 0.5-0.6，肉眼觀察到現(xiàn)象為濃云霧狀；5. 離心操作：隨著離心操作次數(shù)的增加，細(xì)菌會變得越來越脆弱和松散，所以 在進行吸液操作時應(yīng)極為小心， 在保證不吸走細(xì)菌的前提下， 盡量移除上清;6. 無菌操作：注意無菌操作，注意別離酒精燈火焰太近，否則導(dǎo)致細(xì)菌燙死;7. 理解掌握每步操作的原理和注意事項;十三、轉(zhuǎn)化1. 轉(zhuǎn)化方法：熱擊轉(zhuǎn)化和電擊轉(zhuǎn)化;2. 注意事項：無菌操作，冰上操作

12、，快速操作;3. 感受態(tài)細(xì)菌與 DNA （連接產(chǎn)物或質(zhì)粒）復(fù)合時，應(yīng)把 DNA 加入感受態(tài)細(xì)菌 中，并在冰上放置一段時間，以保證 DNA 與感受態(tài)細(xì)菌的表面從分接觸;4. 理解掌握每步操作的原理和注意事項;十四、 平板克隆篩選1. 抗生素平板制備：加入抗生素時，注意培養(yǎng)基的溫度，太高容易導(dǎo)致抗生素?zé)崾Щ?，太低容易?dǎo)致培養(yǎng)基提取凝固，從而不能進行倒板操作;為控制合適的溫度， 應(yīng)不時搖晃瓶子， 這樣保證培養(yǎng)基的溫度與瓶子表面的溫度一致，用手感知瓶子表面的溫度，以不燙手為宜;2. 菌液涂布：加入合適的菌液并涂布均勻，菌液加多了，平板不易涂布均勻和干燥，加上轉(zhuǎn)化效率較高，則導(dǎo)致菌落太密，菌液加少了，平

13、板不易涂布均勻，加上轉(zhuǎn)化效率較低，則導(dǎo)致菌落太稀疏，因轉(zhuǎn)化效率不能提前得知，為保證成功率，可進行梯度涂板;3. 培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度按照該細(xì)菌的生長溫度，倒扣培養(yǎng)，切勿正置培養(yǎng)，培養(yǎng)時間一般不超過12-16h,否則容易長出衛(wèi)星菌（細(xì)菌發(fā)生突變了），后期加強觀察，根據(jù)菌落大小隨時取出，并倒扣（并用封口膜封口）放置于4C4. 克隆平板從4C取出時或后面的觀察和使用操作均需保證平板倒扣放置，否則平板上的冷凝水與克隆接觸，從而導(dǎo)致菌落交叉污染；5. 理解掌握每步操作的原理和注意事項；十五、 細(xì)菌培養(yǎng) 1.接種：用牙簽挑取菌落（放置于 4C下超過2周的菌落不易使用）并在培養(yǎng)基中潤洗，或用槍頭吹打甘油菌（在

14、-80 C下放置），然后槍頭在培養(yǎng)基中潤洗；培養(yǎng)體積不可超過培養(yǎng)器皿總體積的 1/3； 2. 培養(yǎng)條件：嚴(yán)格按照目的細(xì)菌的生長溫度，保證振蕩速度不低于 225RPM，這樣可以保證換氧充分， 生長旺盛；培養(yǎng)時間不要超過 16小時， 否則細(xì)菌老 化，抗性丟失，質(zhì)粒產(chǎn)量嚴(yán)重降低；3. 理解掌握每步操作的原理和注意事項；十六、 質(zhì)粒提取1. 提取試劑盒：如果提取的質(zhì)粒只需進行酶切鑒定，請使用 OMEGA 廠家或其 它國產(chǎn)生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的小量試劑盒即可，如果提取的質(zhì)粒需進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，請使用 QIAGEN 廠家生產(chǎn)的中量提取試劑盒， 這樣可以包裝足夠的產(chǎn)量和純度（超螺旋結(jié)構(gòu)，具有轉(zhuǎn)染活性） ；2. 用于質(zhì)粒

15、提取的細(xì)菌的培養(yǎng)時間不要超過 16 小時；3. 注意事項：不是用于提取質(zhì)粒的菌量越多，質(zhì)粒的產(chǎn)量就越多，因為質(zhì)粒提取試劑盒的每份試劑的能力是有限的，超過每份試劑的能力，反而導(dǎo)致產(chǎn)量減低；4. 理解掌握每步操作的原理和注意事項；十七、酶切鑒定1. DNA 的用量：一般使用 0.5-1ug, 這樣可以保證條帶清晰，酶切充分；如果酶切產(chǎn)物中有目的條帶小于250bP,使用考慮使用較多DNA進行酶切，否則目的 條帶不清晰；2. 限制性內(nèi)切酶的用量： 根據(jù)酶的活性單位進行添加， 一般 1ul 酶含 10 個活性 國際單位，可以在 1 小時內(nèi)充分酶切 1ugDNA ，一般酶的用量不能超過酶切體系的 1/10 體積，否則產(chǎn)生星活性（酶切不特異）3. 酶切體系：酶切總體系一般為 20-30ul,體系大，可以使抑制酶切的因素稀釋，但做瓊脂糖凝膠電泳時需要配制較厚的膠，根據(jù) DNA 的濃度和純度選擇合 適的酶切體系；4. 緩沖液：根據(jù)限制性內(nèi)切酶廠家的要求選擇合適的緩沖液（buffer），進行雙酶切時，查詢廠家提供的雙酶切反應(yīng)緩沖液表格即可；5.