DCC基因與結(jié)直腸癌的研究進(jìn)展

1、DCC基因與結(jié)直腸癌的研究進(jìn)展【關(guān)鍵詞】 DCC基因 結(jié)直腸癌 研究進(jìn)展結(jié)直腸癌是常見的人類消化道惡性腫瘤，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家及我國(guó)部分地區(qū)，其發(fā)病率居惡性腫瘤第二位。它的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多步驟、多階段參與的復(fù)雜過程，包括癌基因的激活，抑癌基因的缺失或失活，錯(cuò)配修復(fù)基因的突變及危險(xiǎn)修飾基因改變等。其中抑癌基因的異常在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，其失活或缺失導(dǎo)致該基因的功能缺失，從而導(dǎo)致細(xì)胞去調(diào)節(jié)性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移潛能1,2。結(jié)直腸癌缺失基因(deleted in colorectal carcinoma，DCC)是一個(gè)重要的抑癌基因 ，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后關(guān)系密切，由

2、Fearon等1于1990年確定并命名，本文就其研究進(jìn)展綜述如下。1 DCC基因1.1 DCC基因及蛋白結(jié)構(gòu) Vogelstein等2發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌染色體缺失最常發(fā)生在17p和18q,發(fā)生率通常在70以上，其中17p等位基因缺失丟掉了p53基因，由此推測(cè)18q缺失可能也丟掉了一種抑癌基因。這個(gè)關(guān)鍵的區(qū)域可能存在于18q21.3和端粒之間。1990年Fearon等1用探針p1565作southern雜交將其準(zhǔn)確定位于18q21.3，在這個(gè)部位進(jìn)行cDNA克隆并篩選，對(duì)所篩選克隆進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)所有克隆均包含一轉(zhuǎn)錄體的重疊部分，該轉(zhuǎn)錄體內(nèi)有單一開放閱讀框架，于是把編碼這一轉(zhuǎn)錄體的基因稱作DCC基因

3、。DCC基因定位于人染色體18q21.3，全長(zhǎng)300400kb，至少含有28個(gè)外顯子,cDNA長(zhǎng)約4341bp。Cho等3從基因庫里分離出含所有已知編碼序列的噬菌體，克隆其完整全長(zhǎng)1.4Mb,確定了第 29號(hào)外顯子的存在，并確定了每個(gè)內(nèi)外顯子的邊界序列。DCC基因的表達(dá)蛋白是型跨膜糖蛋白，由1447個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為190KD。該蛋白主要包括3個(gè)功能區(qū)，即胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)是結(jié)合其配體Netrin1的區(qū)域，由4個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域IG(Immunoglobulin)和6個(gè)型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域FN3(Fibronectin Type)組成，簇集的免疫球蛋白和纖維連接蛋白樣功能

4、區(qū)為神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(NCAM)等免疫球蛋白超家族的特點(diǎn)，已知NCAM及其它細(xì)胞表面糖蛋白相似的機(jī)制，參與細(xì)胞之間，細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，使細(xì)胞維持正常的分化和生長(zhǎng)?？缒^(qū)富含疏水性氨基酸1,4。胞內(nèi)區(qū)是信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)，包括Caspases切割位點(diǎn)，而Caspases是細(xì)胞凋亡通路的主要蛋白酶。作為依賴性受體，缺乏配體Netrin1時(shí)，DCC誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在Netrin1存在時(shí)，DCC與其結(jié)合則對(duì)細(xì)胞凋亡起抑制作用。1.2 DCC基因誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制 Tanaka等5向DCC缺失的直腸癌細(xì)胞中導(dǎo)入含有正常DCC基因的18號(hào)染色體，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞恢復(fù)了DCC的表達(dá)能力后，能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、集

5、落形成及裸鼠體內(nèi)的致瘤能力。Narayanan等6用自然轉(zhuǎn)化可能性很低的 Rat1纖維母細(xì)胞 ，建立了能穩(wěn)定表達(dá)的地塞米松可誘導(dǎo)的 DCC反義 RNA的細(xì)胞株，這種細(xì)胞生長(zhǎng)率增加，并且使裸鼠具有了致瘤性。目前關(guān)于DCC的確切機(jī)制尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)DCC發(fā)揮腫瘤抑制作用可能與其能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。Mehlen等7人發(fā)現(xiàn)缺乏配體Netrin1時(shí)，DCC誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，反之與Netrin1結(jié)合時(shí)則抑制凋亡。因此，DCC具有"依賴性受體"的功能DCC的ADD(Addiction Dependence Domain)位于Caspase切割位點(diǎn)的上游，通過被Caspase切割后釋

6、放羧基末端引起結(jié)構(gòu)變化而暴露。最近有學(xué)者8認(rèn)為DCC誘導(dǎo)凋亡可能與死亡受體通路或線粒體通路不同。在缺乏Netrin1時(shí)， DCCCaspase活化復(fù)合體即凋亡體(apoptosome)的形成，它包括了APPL(也稱為DIP13a)。在此過程中不需要線粒體釋放細(xì)胞色素C、也不需要與凋亡蛋白酶激活因子APAF1(apoptotic protease activating factor 1)相作用，APPL能直接結(jié)合DCC，在介導(dǎo) DCC誘導(dǎo)凋亡方面起正性作用。這表明DCC擁有一個(gè)新的凋亡通路。另外，Kim等9發(fā)現(xiàn)netrinl能夠通過泛素一蛋白酶體途徑降解細(xì)胞表面的DCC，從而調(diào)節(jié)DCC蛋白的表達(dá)

7、。2 DCC基因失活的機(jī)制及檢測(cè)的方式2.1 失活的機(jī)制 抑癌基因失活的方式有：等位基因缺失、點(diǎn)突變、染色體重組、抑癌基因產(chǎn)物與病毒或細(xì)胞的失活蛋白結(jié)合等10。而DCC基因的改變方式主要有：等位基因雜合性缺失、5'端純合性缺失、外顯子的點(diǎn)突變以及DCC基因過甲基化等11 。等位基因雜合性缺失可能是DCC基因失活最普遍的機(jī)制。多數(shù)研究表明， DCC等位基因的雜合性缺失(Loss Of Heterozygosity ，LOH)發(fā)生率一般在66%75%之間。如Fearon等12在41例結(jié)直腸癌中檢測(cè)到29例(71%)DCC 基因等位缺失近年來位于DCC基因3號(hào)外顯子的201密碼子點(diǎn)突變較為受

8、到關(guān)注，突變形式為CGA(精氨酸)CCA(甘氨酸)。RIEKO MINAMI等13分析了191結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織(36例為扁平型，81例為息肉型，74例為進(jìn)展期)及30例正常對(duì)照組織，201密碼子的突變率扁平型為62%，息肉型55%，進(jìn)展期為58%，而正常對(duì)照組的僅為17%。這項(xiàng)研究提示201密碼子的突變不僅與結(jié)直腸癌的早期發(fā)生有關(guān)，還可作為篩選結(jié)直腸癌高危組的生物學(xué)標(biāo)記。馬利民等14采用等位基因特異性 PCR,ASPCR結(jié)合SalI酶切方法檢測(cè)35例結(jié)直腸癌組織及配對(duì)的癌旁黏膜DCC基因201密碼子突變情況，發(fā)現(xiàn)DCC基因201密碼子純臺(tái)突變率結(jié)直腸癌(40%)，顯著高于癌旁黏膜 (2.

9、8%)，且與腫瘤侵襲深度、Dukes分期相關(guān)。至少有l(wèi)7例(49%)結(jié)直腸癌與相應(yīng)癌旁黏膜相比增獲一個(gè)密碼子突變。提示201密碼子突變與結(jié)直腸癌侵襲、 轉(zhuǎn)移能力加強(qiáng)密切相關(guān)。這對(duì)于 DCC基因失活與結(jié)直腸癌發(fā)生的關(guān)系很有意義。2.2 DCC基因變異的檢測(cè)方式 目前用來檢測(cè) DCC變異的方法主要有:(1)通過PCR擴(kuò)增聚丙烯酰胺凝膠電泳分離或者通過熒光PCR自動(dòng)生成以檢測(cè)腫瘤組織的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性;(2)應(yīng)用PCRSSCP、DHPLC和DNA測(cè)序等方法檢測(cè)DCC基因突變;(3)應(yīng)用甲基化特異性PCR檢測(cè)DCC基因的甲基化狀態(tài)。這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性可以間接反映DCC基因是否失活，較為

10、簡(jiǎn)單，可靠，但該方法沒有真實(shí)地反映出微衛(wèi)星位點(diǎn)在全部DNA序列上的變異。SSCP或DHPLC可以檢測(cè)DCC基因突變的情況，但是每次反應(yīng)只能檢出檢測(cè)基因的個(gè)別外顯子，而且不能確定變異位置和變異類型，檢測(cè)DCC基因甲基化狀態(tài)可以反映DCC甲基化情況，對(duì)于腫瘤非遺傳機(jī)制的研究可以提供一個(gè)依據(jù)，但甲基化狀態(tài)的研究放映的只是DCC基因發(fā)生改變的可能的一小部分機(jī)制而已。因此，在對(duì)DCC基因進(jìn)行研究時(shí)，我們有必要對(duì)以上技術(shù)進(jìn)行篩選，根據(jù)目的要求選擇合適的方法。3 DCC基因與結(jié)直腸癌3.1 DCC基因失活與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展 大多數(shù)研究表明DCC基因的失活與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展成正相關(guān)。Mazelin L

11、等15用小鼠(APC)/DCC基因敲除模型顯示小鼠DCC基因的缺失。DCC基因具有促細(xì)胞凋亡作用，這與半胱氨酸蛋白的裂解作用有關(guān)，半胱氨酸蛋白暴露于DCC受體的抗凋亡區(qū)域，可被netrin1抑制。在小鼠模型上過度表達(dá)的netrin1和APC基因的缺失抑制了促細(xì)胞凋亡作用，并可能跟促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)。Vogelstein等1報(bào)道,在結(jié)直腸黏膜上皮由正常上皮轉(zhuǎn)化為增生上皮和腺瘤,并演進(jìn)到癌變的過程中,有47%的進(jìn)展期腺瘤(腺體或細(xì)胞呈中、重度不典型增生)和73%的結(jié)直腸癌細(xì)胞中可檢出染色體18q有DCC等位基因的雜合性缺失(Loss Of Heterozygosity,LOH),但在早中期腺瘤(&a

12、mp;lt;110 cm) 很少見。而在90%的有18qLOH的病人中,缺失區(qū)包含了DCC基因位點(diǎn)5,16。Goi等17用Westernbloting法檢測(cè)結(jié)腸癌及腺瘤中的DCC蛋白表達(dá)情況,則發(fā)現(xiàn)癌組織中DCC蛋白明顯減少或缺失,在腺瘤組織中DCC蛋白有明顯表達(dá),與正常組織幾乎相同,提示DCC基因缺失或失活是結(jié)腸腺瘤向癌轉(zhuǎn)變的一個(gè)促發(fā)因素。而另外一些專家認(rèn)為DCC基因的缺失與否與結(jié)直腸癌沒有直接關(guān)系。如KeinoMasu K等18研究表明DCC基因編碼的蛋白是netrin1介導(dǎo)作用的受體復(fù)合物的組成部分，netrin1參與了軸突導(dǎo)向。對(duì)人類結(jié)直腸癌的研究表明只有7%的結(jié)直腸癌有netrin1

13、的過度表達(dá)，這可能提示18q上基因缺失DCC受體復(fù)合物的缺失或突變對(duì)人類結(jié)直腸癌細(xì)胞的篩選并沒有特別的優(yōu)勢(shì)。3.2 DCC基因失活與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后 大部分學(xué)者認(rèn)為DCC基因的失活促進(jìn)了結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，肝肺轉(zhuǎn)移等，從而使其預(yù)后更差。Jen等19發(fā)現(xiàn)沒有DCC基因缺失的二期直腸癌患者的生存率和三期患者相同，而DCC基因缺失者則與一期患者相同 ， 均提示DCC基因和腫瘤轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。 Kato等20通過對(duì)30例結(jié)直腸癌無肝轉(zhuǎn)移，24例結(jié)直腸癌有肝轉(zhuǎn)移及9例術(shù)后肝轉(zhuǎn)移進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移病例與未發(fā)生肝轉(zhuǎn)移病例DCC基因缺失率分別為95%40%，因此認(rèn)為DCC基因的缺失可能與結(jié)

14、直腸癌的肝轉(zhuǎn)移有關(guān)。MARTIN21研究發(fā)現(xiàn)，DCC蛋白可以作為腫瘤轉(zhuǎn)移或局部浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的抑制因子，與導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞相互作用及黏附功能減弱有關(guān)，DCC蛋白功能的丟失與腫瘤的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有密切關(guān)系。國(guó)內(nèi)學(xué)者吳文溪等22采用免疫組化法檢測(cè)40例正常結(jié)直腸黏膜，66例結(jié)直腸癌及相應(yīng)癌旁組織DCC蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌DCC蛋白陽性表達(dá)率為39.4%。不僅明顯低于癌旁組織(97.0%)和正常對(duì)照組(100%)，而且與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腸壁浸潤(rùn)深度呈負(fù)相關(guān)。Shibata等23對(duì)132例石蠟油包埋的完整切除的DukesB 和DukesC期結(jié)直腸癌標(biāo)本用免疫Zetter組化的方法來檢測(cè)DCC基

15、因的表達(dá)并長(zhǎng)期隨訪，發(fā)現(xiàn)DCC基因表達(dá)正常的DukesB期患者5年生存率是94.3%，同期DCC基因表達(dá)缺失的患者5年生存率是61.6% ，DukesC期的分別是59.3%和 33.2%.由此說明了DCC基因是DukesB 和DukesC期結(jié)直腸癌強(qiáng)有力的預(yù)后指標(biāo)，但是這項(xiàng)研究采用Western blotting法檢測(cè)結(jié)直腸癌中DCC蛋白的表達(dá)情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)DCC蛋白的表達(dá)與否和肝轉(zhuǎn)移沒有相關(guān)性。而Gotley DC等24通過比較結(jié)直腸的正常黏膜，腺瘤組織，癌組織及肝轉(zhuǎn)移組織的DCC蛋白表達(dá)，認(rèn)為DCC基因與大腸癌的進(jìn)展及肝轉(zhuǎn)移并無直接關(guān)系。在研究DCC基因表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系中， Saito

16、M等25比較DCC基因表達(dá)正常組和DCC基因缺失組的5年生存率分別為91.0%和58.8%，兩者之間有顯著差異，提示 DCC基因可能可以作為預(yù)后的一個(gè)生物學(xué)標(biāo)記。4 問題與展望DCC基因是目前發(fā)現(xiàn)的最長(zhǎng)的人腫瘤抑制基因，尤其在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，其失活和表達(dá)異常與結(jié)直腸癌的診斷、治療、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切。盡管目前對(duì)DCC基因的研究有了很大的進(jìn)步，但是關(guān)于DCC基因的失活機(jī)制、DCC蛋白的功能、DCC基因與其它基因是如何協(xié)同作用與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中DCC基因誘導(dǎo)細(xì)胞分化的機(jī)制尚未完全清楚。 DCC基因失活及DCC蛋白表達(dá)缺失是否可以作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素用于指導(dǎo)臨床治療工

17、作等仍然有許多問題有待于進(jìn)一步解決?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Fearon ER, Cho KR, Nigro JM, et al. Identification of a chromosome 18q gene that is altered in colorectal cancersJ. Science JT Science (New York, N.Y.), 1990,247:4956.2Vogelstein B,Feoron ER,Hamilton SR, et al. Genetic alteration during colorectal tumor developmentJ. NEnglJ

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