保留殘跡對前交叉韌帶重建移植物愈合影響的組織學(xué)研究

1、保留殘跡對前交叉韌帶重建移植物愈合影響的組織學(xué)研究【摘要】 ：目的觀察保留殘跡對前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)重建移植物愈合的影響，并探討其原因。方法新西蘭兔30只(封閉群，體重2.93.5 kg，平均3.2 kg)隨機(jī)分為3組，每組10只。取其跟腱為移植物，切斷雙側(cè)前交叉韌帶，隨機(jī)一側(cè)保留ACL殘跡，對側(cè)切除殘跡，行前交叉韌帶重建。分別于術(shù)后4、8、12周處死動(dòng)物，取關(guān)節(jié)內(nèi)重建ACL移植物標(biāo)本10多聚甲醛固定、10EDTA脫鈣、包埋、切片，HE染色及Masson、PAS特殊組織化學(xué)染色，檢測成纖維細(xì)胞密度及觀察組織學(xué)形態(tài)，數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0

2、軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果各時(shí)間段保留殘跡組移植物HE染色組織切片成纖維細(xì)胞密度均高于切除殘跡組，兩組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，兩處理組8周時(shí)細(xì)胞密度高于4、12周，不同時(shí)間段比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。各時(shí)間段保留殘跡組移植物的組織學(xué)表現(xiàn)均優(yōu)于切除殘跡組。結(jié)論保留殘跡ACL重建有利于新生細(xì)胞長入替代移植物，促進(jìn)移植物組織結(jié)構(gòu)成熟。 【關(guān)鍵詞】 膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶殘跡重建愈合 Abstract：ObjectiveTo observe the effects of preserving the remnant on healing of ACL autog

3、raft in anterior cruciate ligament (ACL) reconstruction,and discuss the reasons.MethodForty closed colony New Zealand rabbits with the average weight of 3.2 kg were divided into 3 groups at random,each group had 10 rabbits.The anterior cruciate ligament of the rabbit was cut off in both knees,the re

4、mnant of original ACL was preserved on one side and removed on the opposite side at random,then single bundle anterior cruciate ligament reconstruction was conducted with autogeneous achilles tendon graft.Animals were executed and the intraarticlar graft specimens were taken at 4,8,12,weeks postoper

5、atively respectively.The specimens were fixed with 10 % paraformaldehyde,decalcified with 10% EDTA.The specimens were taken and embeded,sliced,and then strained with HE and Masson,PAS special histochemistry to observe fibroblast density and histopathological situation.Statistical analysis were carri

6、ed out using SPSS 12.0 software.ResultIn each time section,the fibroblast density of ACL grafts tissue section with HE dyeing in preservingremnant group was higher than that in removingremnant group,there was significant difference between two groups (P<0.05).The density of 8 week time sectio

7、n was higher than those of 4 week time section and 12 week time section.There was significant difference among different time sections in each treatment group (P<0.05),the histological appearance of ACL grafts of preservingremnant group was better than that of removingremnant group.Conclusion

8、The ACL reconstruction by preservingremnant is beneficial to the newborn cells/ growing in of the ACL grafts and beneficial to the histological maturity of the ACL grafts. Key words：knee; anterior cruciate ligament; remnant; reconstruction; healing前交叉韌帶損傷是膝關(guān)節(jié)外傷中常見的損傷之一，應(yīng)用自體半腱肌和股薄肌肌腱進(jìn)行前交叉切帶重建的手術(shù)方法己逐漸

9、成熟，其供區(qū)病損小、對伸膝裝置無干擾、可取得與采用髕韌帶重建類似的膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定效果，已成為國內(nèi)外治療ACL損傷的主流重建方法1，重建術(shù)后移植物的良好愈合是手術(shù)取得成功的關(guān)鍵。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)，原ACL殘跡(remnant of ACL)對重建后移植物的再血管化以及細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，并可促進(jìn)神經(jīng)再生，因此，保留殘跡的手術(shù)方法可能更有利于移植物的愈合。目前已有相關(guān)的臨床研究2,8,9，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還未見報(bào)道。本研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對保留殘跡ACL重建與切除殘跡重建ACL進(jìn)行組織學(xué)對比研究，以探討保留殘跡ACL重建的手術(shù)方法對ACL移植物愈合的影響。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 新西蘭兔(封閉

10、群)，數(shù)量30只，體重（2.6±0.2）kg，雌、雄各半，用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)化分組，按飼養(yǎng)時(shí)間4、8、12周分為3組，每組10只。動(dòng)物麻醉后仰臥手術(shù)臺(tái)上，屈膝90° (圖1a)，取跟部后正中切口，切取跟腱外側(cè)23作為移植腱。將跟腱修整至長約5 cm，直徑為2 mm，兩端編織縫合，保留尾線作為牽引線(圖1b)，置于生理鹽水中備用。行關(guān)節(jié)外側(cè)縱切口，將髕骨牽向內(nèi)側(cè)至脫位，暴露關(guān)節(jié)腔。切斷ACL，隨機(jī)一側(cè)保留上、下端殘跡各約2 mm長，另一側(cè)完全切除上下端殘跡。沿原ACL方向，在定位器導(dǎo)引下在脛骨止點(diǎn)處向下、內(nèi)用2 mm鉆頭鉆取脛骨隧道，同樣方法，鉆取股骨隧道，在牽引線引導(dǎo)下，

11、將制備好的移植物植入骨隧道內(nèi)，移植物兩端拉出骨隧道外部分反折，并以牽引線拉緊縫合于隧道外口軟組織上(圖2)，逐層間斷縫合切口。術(shù)后不予外固定，分籠飼養(yǎng)， 自由活動(dòng)。1.2 標(biāo)本采集與處理 于術(shù)后4、8、12周分別處死動(dòng)物，打開膝關(guān)節(jié)腔，生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)。切取關(guān)節(jié)內(nèi)重建的前交叉韌帶的移植物標(biāo)本，10多聚甲醛固定、10EDTA脫鈣，常規(guī)脫水、透明、浸臘、包埋。制備5 的移植物縱向切片，分別行HE染色及Masson、PAS特殊組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察，記錄觀察結(jié)果。1.3 組織形態(tài)計(jì)量與數(shù)據(jù)處理 HE染色切片在IPP(ImagePro Plus System)通用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(泰山醫(yī)學(xué)院生命科

12、學(xué)研究所提供)下隨機(jī)取5個(gè)高倍視野(每高倍視野面積約0.5 mm2)進(jìn)行成纖維細(xì)胞核計(jì)數(shù)，取平均值，得出每高倍視野成纖維細(xì)胞密度。各組數(shù)據(jù)用±s表示，使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行時(shí)間段內(nèi)方差分析、總體數(shù)據(jù)2×3析因分析。2 結(jié) 果2.1 顯微形態(tài)觀察結(jié)果 4周時(shí)，保留殘跡組見較多新生細(xì)胞自外周侵入移植物，膠原纖維排列紊亂，PAS著色淡；切除殘跡組新生細(xì)胞侵入較少，膠原纖維排列更加紊亂，PAS著色淡。8周時(shí)，保留殘跡組移植物可見大量新生細(xì)胞，主要為成纖維細(xì)胞，膠原纖維排列仍紊亂，PAS著色有明顯增強(qiáng)(圖3a)；切除殘跡組移植物可見大量新生細(xì)胞，但數(shù)量較保留殘跡組少，膠原

13、纖維排列紊亂，PAS著色較保留殘跡組淡(圖3b)。12周時(shí)，保留殘跡組移植物內(nèi)細(xì)胞數(shù)有明顯減少(圖4a)，形狀多為長梭形，膠原纖維排列整齊(圖5a)，PAS著色較好；切除殘跡組移植物內(nèi)細(xì)胞數(shù)較少(圖4b)，膠原纖維排列比較整齊，但較保留殘跡組稍差(圖5b)，PAS著色較保留殘跡組淡。2.2 移植物成纖維細(xì)胞密度 各組HE染色切片每高倍視野成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)(細(xì)胞密度)結(jié)果及SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件2×3析因分析結(jié)果見表1?？梢姼鲿r(shí)間段保留殘跡組移植物成纖維細(xì)胞密度均高于切除殘跡組，兩組比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。2處理組在術(shù)后4周時(shí)成纖維細(xì)胞密度較低，8周時(shí)達(dá)

14、到高峰最高，12周時(shí)細(xì)胞密度降低(圖6)，8周時(shí)細(xì)胞密度明顯高于4、12周，2處理組不同時(shí)間段比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。時(shí)間與手術(shù)方法間存在交互效應(yīng)(P<0.05)。表1 移植物成纖維細(xì)胞密度（略)注（1）#P>0.05,P<0.05,P<0.05;(2)2處理組4、8、12周比較P<0.05。3 討 論 前交叉韌帶重建后自體肌腱移植物的愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，多數(shù)研究者著重于ACL重建移植物骨隧道內(nèi)組織愈合過程即腱-骨愈合過程。近年來的研究普遍認(rèn)為：骨隧道的內(nèi)愈合首先形成一圈富含血管的纖維結(jié)締組織帶（界

15、面組織）填充在腱與骨之間3，4，隨后來源于隧道骨組織的成纖維細(xì)胞逐漸長入，形成連接，繼而形成類似直接韌帶-骨止點(diǎn)的結(jié)構(gòu)5。關(guān)節(jié)內(nèi)移植腱大致要經(jīng)歷缺血壞死、血管重建、細(xì)胞增殖和塑型成熟4個(gè)階段，最終成為類似韌帶的結(jié)構(gòu)。這一過程主要由關(guān)節(jié)內(nèi)組織細(xì)胞“爬行替代”重建ACL的移植腱。王永健等6應(yīng)用半腱肌腱重建前交叉韌帶術(shù)后觀察關(guān)節(jié)腔內(nèi)重建移植物組織學(xué)形態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn)：移植手術(shù)后第2周，可見關(guān)節(jié)腔內(nèi)的肌腱組織壞死，表現(xiàn)為細(xì)胞核溶解，新生的組織尚未長入替代；術(shù)后1個(gè)月，見到有大量新生的細(xì)胞從移植物外周向中心長入，新生細(xì)胞呈梭形，較正常半腱肌腱和前交叉韌帶細(xì)胞的體積大；術(shù)后第2個(gè)月，關(guān)節(jié)腔中的移植物富含細(xì)胞，呈類

16、圓形，膠原纖維排列無序；術(shù)后第4個(gè)月，移植物中細(xì)胞數(shù)目接近正常前交叉韌帶，細(xì)胞呈長梭形，膠原纖維縱向排列比較整齊；術(shù)后第6個(gè)月，移植物細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)已經(jīng)類似正常前交叉韌帶，膠原纖維縱向排列整齊有序，并具有很好的彈性；術(shù)后第9個(gè)月，移植物組織學(xué)形態(tài)進(jìn)一步成熟，細(xì)胞及膠原纖維排列更加整齊有序；術(shù)后第12個(gè)月，細(xì)胞形態(tài)更加類似正常前交叉韌帶的短桿狀并在局部出現(xiàn)成串狀排列。在本實(shí)驗(yàn)中通過對每高倍視野成纖維細(xì)胞數(shù)量(細(xì)胞密度)的檢測來評價(jià)移植物的愈合程度，發(fā)現(xiàn)術(shù)后8周時(shí)成纖維細(xì)胞密度最高，明顯高于4、12周，這與王永健的研究結(jié)果一致，說明移植腱關(guān)節(jié)內(nèi)愈合過程中，移植物細(xì)胞數(shù)量均經(jīng)歷先增多后下降過程。 在

17、臨床中重建ACL手術(shù)時(shí)往往將原ACL的殘跡完全清除，以更好地暴露韌帶止點(diǎn)、定位骨隧道內(nèi)口。近年來國內(nèi)外許多學(xué)者逐漸認(rèn)識(shí)到原ACL殘跡對ACL移植物的愈合有重要的促進(jìn)作用。Georgoulis等7研究認(rèn)為原ACL殘跡中的本體感受器有可能是ACL移植物神經(jīng)再分布的重要來源。Lee等8認(rèn)為殘跡有利于移植物再血管化以及細(xì)胞增殖，因此主張最大限度保留ACL殘跡。孫磊等9認(rèn)為殘跡有利于移植物血供和神經(jīng)支配的重新獲得，并可以封閉骨隧道關(guān)節(jié)內(nèi)口，阻止關(guān)節(jié)滑液自隧道口進(jìn)入骨隧道內(nèi)，從而有利于移植物隧道內(nèi)的愈合。本研究在IPP圖像分析系統(tǒng)輔助下檢測移植物的成纖維細(xì)胞密度，得出數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，術(shù)后4、8、1

18、2周保留殘跡組的細(xì)胞密度均顯著高于切除殘跡組，提示ACL被切斷后，殘跡滑膜有血供，殘跡內(nèi)的組織細(xì)胞仍未喪失活力，可以向移植物內(nèi)長入替代，從而大大促進(jìn)移植物的細(xì)胞增生。 伴隨新生細(xì)胞長入移植腱并增生，產(chǎn)生膠原和蛋白多糖等基質(zhì)，并對移植腱原有基質(zhì)替代改建。Goradia10發(fā)現(xiàn)ACL重建后移植物內(nèi)膠原纖維排列隨時(shí)間增加由紊亂逐漸沿韌帶縱軸整齊排列。Goertzen等11采用HE、PAS染色等方法觀察犬前交叉韌帶重建后組織學(xué)變化，認(rèn)為新生細(xì)胞長入能促進(jìn)重建后移植物的生物力學(xué)及組織學(xué)特性向韌帶轉(zhuǎn)化。Masson染色可以較好地顯示膠原纖維的排列情況，PAS染色可以顯示移植物基質(zhì)內(nèi)蛋白多糖的分布情況12。

19、本研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后412周保留殘跡組與切除殘跡組ACL移植物的膠原排列與蛋白多糖表達(dá)也有差別，保留殘跡組相對于同時(shí)間組內(nèi)切除殘跡組膠原排列更為規(guī)整，且PAS染色著色較深。這進(jìn)一步說明保留殘跡有利于細(xì)胞長入移植腱，增生并產(chǎn)生新的細(xì)胞基質(zhì)，促進(jìn)膠原纖維的改建與重排列，改善移植物的生物力學(xué)特性，使其更加接近正常韌帶。綜上所述，筆者認(rèn)為，ACL殘跡并非無用組織，它可以促進(jìn)ACL重建移植物的愈合，ACL重建手術(shù)應(yīng)盡量保留ACL殘跡?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Lawhorn KW,Howell SM.Principles for using hamstring tendons for anterior cruciate

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