銀染增強的納米金標記探針對微量核酸的檢測

1、ISS N 100727626C N 1123870Q中國生物化學與分子生物學報2006年 11月 22(11 :919923 技術與方法銀染增強的納米金探針技術檢測微量核酸趙立凡 , 李柏生 , 黑笑涵 , 李曉波 , 李媛媛 , 徐順清3(華中科技大學同濟醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院 環(huán)境醫(yī)學研究所 環(huán)境與健康教育部重點實驗室 , 武漢 430030摘要 利用銀染增強的納米金技術建立了一種簡單快速的核酸定量方法 . 該方法基于納米金與烷巰基修飾的寡核苷酸分子共價鍵合作用 , 將納米微粒報告基團標記在與靶核酸一端序列互補的寡 核苷酸上 , 同時生物素化修飾另一端互補序列 . 靶核酸與兩段寡核苷酸探針

2、雜交后 , 借親和素固定 在酶標板孔內(nèi) , 通過納米金催化的銀染放大效應產(chǎn)生高靈敏的識別信號 , 適時記錄其吸光度值從而 實現(xiàn)核酸分子的定量 . 該檢測方法檢測單鏈核酸分子的靈敏度達 011fm ol L , 雙鏈分子為 10fm ol L. 關鍵詞 納米金 ; 核酸檢測 ; 銀染增強 中圖分類號 R115A Colorimetric B ased onN E nhancement2, X iao 2Han , LI X iao 2Bo , LI Y uan 2Y uan ,X U Shun 2Qing3K ey Laboratory o f Environment and H ealth ,

3、 School o f Public H ealth , Tongji Medical College o fHuazhong University o f Science and Technology , Wuhan 430030, China Abstract A sim ple g old nanoparticle 2based method to detect micro am ount of polynucleotide m olecules withsilver staining enhancement is established. Based on the covalence

4、action of thiol 2m odified olig onucleotides with nanoparticles , the nanoparticles was utilized as biomarkers to detect trace am ount of polynucleotides. T w o kinds of probes , which were respectively com plementary to one half of target polynucleotides , were labeled respectively with biotins and

5、 nanoparticles. The hybridization products of target polynucleotides with these tw o kinds of probes were imm obilized to microplates via avidin 2biotin system , and the signals of g old nanoparticles were subsequently am plified by silver staining s olution , and recorded with colorimetric abs orba

6、nce. This sandwich colorimetric assay can detect as few as 011fm ol L for single 2strand target polynucleotides and 10fm ol L for double 2strand target polynucleotides. K ey w ords g old nanoparticles ; polynucleotides detection ; silver staining enhancement收稿日期 :2006204207, 接收日期 :2006207211國家自然科學基金

7、資助項目 (N o 1203770173聯(lián)系人 T el :027283693417,E 2mail :xushunqingyahoo. com. cnReceived :April 07,2006;Accepted :July 11,2006Supported by National Natural Science F oundation of China (N o 1203770173C orresponding author T el :027283693417,E 2mail :xushunqing yahoo. com. cn 現(xiàn)知的人類疾病都與基因有著直接或間接的關 系 , 核酸的

8、檢測和分析在遺傳性疾病 、 傳染病和腫瘤 等領域的應用日益廣泛 . 以往的方法大多是建立在 標記有放射性核素 , 熒光或化學發(fā)光物質(zhì)的探針與 靶核酸序列雜交的基礎上 . 放射性標記檢測體系需 要特殊培訓的技術人員 , 且還會面臨放射性污染及 標記活性受半衰期限制的問題 . 而熒光標記在其寡 核苷酸序列的制備及雜交檢測方面對儀器設備的要 求均較高 , 且熒光標記物質(zhì)也比較昂貴 , 這是一般實 驗室條件無法達到的 . 另外 , 雖然近年來核酸的擴增 檢測技術迅速發(fā)展并廣泛應用于臨床科研微生物學 檢測等 , 但這些檢測系統(tǒng)和方法往往存在擴增量低 , 自身的引物設計和熒光素標記探針繁瑣 , 對設備要求

9、高及擴增污染等缺陷 1, 限制了該擴增檢測技術 的應用 . 因此特異核酸的檢測亟需建立一種快速 , 高 效 , 易于實施的檢測新方法 .近年來隨著納米技術的發(fā)展 , 一些基于寡核苷 酸修飾納米金標記及其顆粒大小依賴的光散射 , 催 化作用及吸光特性等的核酸定量方法得以進一步研 究 28. Mirkin 等利用納米金在以 DNA 片段為組裝 分子的引導下形成超分子結(jié)構(gòu)的特點 , 建立了用納 米金標記寡核苷酸探針并檢測特定多核苷酸序列的 新方法 , 為特定 DNA 序列檢測的研究和應用開辟了 一個新領域 . Mirkin 等通過納米金標記兩套不同的 單鏈核酸探針同時與目的序列搭橋結(jié)合建立了一種 核

10、酸分析的方法 , 雜交后可形成聚合網(wǎng)絡結(jié)構(gòu) , 溶液 顏色隨之發(fā)生改變 , 通過銀染或滴加少量溶液至 C 18薄層 層 析 板 上 來 觀 察 信 號 的 改 變 9. 已 報 道 的Mirkin 等建立的方法檢測限是 50fm ol L 6. 而我們 發(fā)現(xiàn)目的核酸的濃度與銀染增強的納米金標記探針 信號間存在良好的線性關系 , 在此基礎上建立了更 為簡單靈敏的核酸定量的有效方法 , 檢測單鏈核酸 分子的靈敏度達 011fm ol L , 雙鏈分子為 10 fm ol L.1 材料與方法111 檢測微量核酸技術原理本研究目的在于建立一種靈敏度高 , 選擇性強 的核酸比色定量方法 , 該方法通過優(yōu)

11、化雜交條件利用親和素 2生物素系統(tǒng)實現(xiàn)核酸的檢測 (Fig 11 . 目的 核酸先與生物素標記的互補探針及納米金標記的互 補探針雜交 , 然后將雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)至親和素包被好的 酶標板內(nèi) . 雜交緩沖液為 013m ol L NaCl , 0105%S DS ,10mm ol L 磷酸鹽緩沖液 , 雜交產(chǎn)物即可由親和素 2生物素作用錨定于固相載體酶標板上 , 經(jīng) 1×P BS 和 2×P BN 溶液洗滌 5次后 , 再加銀染增強液 , 雜交信號隨之放大 , . 112 Fig. 1 The scheme of colorimetric method b ased on nanop

12、 articles with silver staining enh ancement(A Hybridization of the target polynucleotides with biotin 2labeled probes and g old nanoparticles 2functioned probes ; (B Imm obilization of the hybridization products to microplates via avidin 2biotin system ;(C Am plification of g old nanoparticle signal

13、s by silver enhancement s olution with the record of colorimetric abs orbance 烷 巰 基 標 記 的 核 酸 序 列 購 于 Invitrag onBiotechnical 公司 ,S eq1:5 2Bio 2gcagtT CC AGG CT CTT CT C A 23 (capturing probe Seq2:5 2TG CCCCGG AG TTG CG TG AG AAG AG CCT GG A 23 (target sequence Seq3:5 2CG C AACTCCGGGG C A 2(CH 2 62S

14、H 23 (nanoparticle probe Seq4:5 2TCC AGG CTCTTCTC ACG C AACTCCGGG G C A 23 (control sequence Seq1和 Seq3溶解于 TE 緩沖液 (10mm ol L Tris 2HCl , 1mm ol L E DT A , pH 714 . 中 ,Seq2和 Seq4直接溶解于超純水中 .直 徑 15nm 的 納 米 金 購 于 Sino 2American Biotechnology 公司 .酶標板 (C orning Star 購于 G enetimes T echonolgy 公司 .AgNO 3, 檸

15、檬酸 、 檸檬酸三鈉及氫醌購于生物工 程 (上海 有限公司 . 113 納米金標記核酸探針的制備按照 Mirkin 2,Zhang 10等所述方法標記納米金 探針 , 具體如下 :29中國生物化學與分子生物學報 22卷a 膠體金溶液 500l ,4 14000r min 離心 20 min , 棄上清 ;b 加巰基標記序列 (Seq3 100m ol L ,3l , 和 47l TE 緩沖液 , 混勻成 50l 體系 14 ,12h ; c 加等體積 (50l 012m ol L NaCl ,20mm ol L P B (20mm ol L Na 2HPO 4NaH 2PO 4,pH 710

16、, 使其終 濃度為 011m ol L NaCl , 10mm ol L P B , 迅速混勻 , 4 ,24h ;d 取上清 ,4 ,14000r min 離心 10min , 棄上 清 , 加 100l 超純水重懸后再次離心 , 棄上清 , 以去 除多余的未標記上的單鏈核酸 ;e 加 100l 011m ol L NaCl ,10mm ol L P B (pH 710 混勻 , 置 4 儲存?zhèn)溆?.114 酶標板包被親和素a 親和素 (1mg ml 用碳酸鹽包被液按 1 100稀釋 , 每孔包被 100l , 潮濕環(huán)境下 4 過夜 ; (鹽包被液 Na2C O 3, 0116g , 3g

17、, ml H 2O ,pH 916;b 1×P 4, 1 (V V T ween20 , 洗 滌 2次 , 拍干 .115 雜交a 雜交緩沖液 (013m ol L NaCl , 0101%S DS , 10 mm ol L P B (pH 718 20l , 生物素標記探針 (Seq1 10 nm ol L ,10l , 不同濃度目的核酸 (Seq2 各 10l , 混 勻 ,25 ,10min ;b 加膠體金標記探針 (Seq3 5l , 混勻 ,25 , 10min ;c 將該 45l 體系雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到各酶標板 孔 ,37 保溫 20min , 傾倒干凈 ;d 1×

18、P BS 洗滌 1次 , 拍干 ,2×P BN (013m ol L NaNO 3and 10mm ol L Na 2HPO 4NaH 2PO 4,pH 710 洗 滌 2次 , 拍干 .116 銀增強 (避光 取銀增強液 015g AgNO32ml H 2O , 12l ; 117g 氫醌 30ml H 2O ,300l ;2155g 檸檬酸 2135g 檸檬酸三鈉 10ml H 2O , 100l.后兩種溶液需新鮮配制 , 確保無結(jié)晶析出且無 色 , 氫醌和檸檬酸 (300l 100l 混和液應在銀染前 30min 左右保持 37溫育 , 銀染用時再 加 12l AgNO 3迅速

19、混勻立即分加入各酶標板孔內(nèi) , 每孔 100l , 放在溫箱里反應 . 反應一定時間后 , 置入超純水 中 , 終止反應 .銀染增強反應最好在避光或弱光下反應 , 以減 少銀自身成核反應 , 增強特異性 1113.117 酶標儀檢測 630nm 處吸光度值2 結(jié)果211 單鏈核酸分子定量該方法檢測單鏈核酸分子簡單快速 , 加入銀增 強劑可顯著放大膠體金標記信號 , 從而可檢測到極 低含量的膠體金 . 本方法對單鏈核酸分子的檢測限 可達 100am ol L (Fig 12 .2ange of the single 2strand target The silver enhance time i

20、s 150s在銀增強時 , 我們觀察到隨著時間的推移 , 銀增 強液的灰度會不斷增加 , 尤其是通過雜交錨定于酶 標板上的納米金顆?？娠@著加速銀顆粒的聚集 , 即 納米金銀染增強信號的吸光度值變化是劑量時間依 賴性的 (Fig 13 . 在一定的時間控制下 , 銀增強的灰 度值變化與不同濃度目的核酸序列 (Seq2 雜交系中 固定于酶標孔內(nèi)的納米金顆粒的量呈正相關 . 通過 一系列實驗優(yōu)化 , 選擇出最合適的時間段 100 150s 終止銀染 , 得出銀增強吸光度值與不同濃度目 的核酸分子的良好線性關系 (Fig 14 .212 雙鏈核酸的定量本研究的核酸比色定量方法依賴于單鏈核酸的 選擇性互

21、補雜交 , 因此 , 為了對雙鏈核酸分子進行定 量 , 先要在加入探針前進行變性 , 探針與變性的原單 鏈互補核酸分子競爭結(jié)合到目的單鏈核酸分子上 , 加入過量的納米金標記探針和生物素標記序列以使 探針雜交競爭超過原互補序列 , 而且通過選擇性結(jié) 合和洗滌 , 可以很大程度上去除未結(jié)合的探針 , 從而 顯著降低背景值 .實驗中 , 雙鏈核酸分子 (Seq2 Seq4 (10l , 不同 濃度 先 95 變性 3min , 然后將 EP 管迅速加入干 冰 異丙醇冰浴 3min , 再加入 10l 生物素標記的探 針液 (Seq1, 100nm ol L , 10l 納 米 金 標 記 探 針 (

22、Seq3 , 及 20l 2×雜交緩沖液 , 室溫下溫育 20 min , 后續(xù)程序同單鏈檢測 . 目前雙鏈檢測核酸最低 129第 11期 趙立凡等 :銀染增強的納米金探針技術檢測微量核酸 Fig. 3 The time 2absorb ance (A relationship of various concentrations of target oligonucleotide with silver staining enh ancement( BFig. 4 Correlation betw een the absorb ance values of silver enh an

23、cement and concentrations of target single 2strand sequenceThe controlled silver enhance time was 150s and the concentrations of target sequence varied from 1pm ol L to 100am ol L. Values represent x ±s of independent triplicate determinations.檢測限為 10fm ol L (Fig 15,6 .Fig. 5 The time 2absorb a

24、nce relationship of various concentrations of double 2strand polynucleotides with silver staining enh ancement實驗結(jié)果顯示 , 觀測到的信號增強是由目的核 酸特異性雜交的結(jié)果 . 在無 Seq2情況下 , 膠體金標 記的探針并不會與生物素標記序列非特異性結(jié)合 , 在加 Seq4而不含 Seq2的陰性對照組中 , 亦無明顯Fig. 6 Correlation betw een the absorb ance values of silver enh ancementandconcentr

25、ationsofdouble 2 strandpolynucleotides (Seq2 Seq4The controlled silver enhance time was 150s and the concentrations of target polynucleotides varied from 100pm ol L to 10fm ol L. Values represent x ±s of independent triplicate determinations.信號增強 .3 討論基于寡核苷酸探針共價連接的可在不同條件下顯示色度信號變化的納米金技術 ,Mirkin

26、等將納米 金標記的核酸探針與互補目的序列雜交成多聚網(wǎng)絡 結(jié)構(gòu) , 膠體金溶液顏色隨之由紅色變藍 14,15, 從而檢 測目的核酸的量 . 該體系的顏色變化給出的雜交信 號依賴于聚合凝聚體中納米金之間的距離 , 因而納米金聚合網(wǎng)絡形成時的沉降會影響終點的觀察 16. 本研究利用生物素標記寡核苷酸序列作為固相末 端 , 將納米金標記探針與互補的目的核酸共雜交產(chǎn) 物錨定于固相載體上 , 可有效避免納米金溶液體系 中聚合網(wǎng)絡沉降對觀察終點的干擾 , 與銀染法結(jié)合 更提高了檢測的靈敏度 .銀增強納米金檢測痕量核酸的方法將目的核酸229中國生物化學與分子生物學報 22 卷與納米金標記探針及生物素標記探針充

27、分雜交后再 將該特異性雜交產(chǎn)物捕獲到固相載體酶標孔內(nèi) , 使 得雜交條件得以充分優(yōu)化從而提高了檢測靈敏度 . 而已有的相關文獻報道中探針多固化在聚丙烯薄片 上再進行雜交 , 如此會影響雜交效率 , 降低檢測靈 敏度 .納米金標記銀增強方法不僅發(fā)揮了納米金標記 的優(yōu)勢 , 更利用了銀染增強技術將信號有效放大 . 但 值得注意的是 , 銀染中銀原子的自身聚合所引起的 一定背景值會干擾納米金催化的銀增強效應的觀 察 , 只有在信號擴增曲線的指數(shù)期相才可以獲得吸 光度值與目的核酸濃度之間良好的梯度關系 . 若銀 染時間過長 (超過 5min , 則銀染強度均到達平臺 期 , 不能區(qū)分梯度關系 . 因此

28、 , 銀增強時間控制在時 間 2吸光度值曲線指數(shù)相內(nèi) , 多次實驗優(yōu)化后一般選 擇 100150s.,.子兩端互補結(jié)合 , 生成 5 端標記生物素和 3 端標記 納米金的雙鏈核酸分子 . 當雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)移入包被有 親和素的酶標孔內(nèi) , 經(jīng)溫育后 , 標有生物素的雙鏈核 酸即被捕獲 , 未結(jié)合的過量探針被洗滌去除 . 通過銀 染增強 , 結(jié)合在酶標孔上的納米金標記信號即可放 大 105倍 , 從而使得納米金標記肉眼都可粗略觀察 到 . 通過檢測其銀染吸光度值可以繪制標準曲線進 行定量檢測 .該納米金標記銀增強檢測方法檢測單鏈核酸的 靈敏度為 011fm ol L , 雙鏈為 10fm ol L ,

29、 方法快速簡 便 、 靈敏度高 , 約 60min 即可完成一次檢測 , 且不需 要特殊儀器或 PCR 擴增 , 可直接檢測樣本中微量的 病原體 DNA , 其顯著優(yōu)勢在于甚至用肉眼觀察即可 獲得半定量結(jié)果 , 因而適用于大量生物樣本的初篩 , 對感染性病原體或遺傳性疾病進行快速檢測及鑒 定 , 可望在基層廣泛推廣 .參考文獻 (R eferences 1 G iulietti A , Overbergh L , Valckx D , et al . An overview of real 2time quantitative PCR :applications to quantify cyt

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