細(xì)胞凋亡與肝臟疾病

1、細(xì)胞凋亡與肝臟疾病健康網(wǎng)訊 :劉增權(quán)李孝生 400010 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科自從 1972 年病理學(xué)家 Kerr 首先對細(xì)胞凋亡進(jìn)行描述以來，經(jīng)過 20 余年的研究，人們認(rèn)識(shí)到細(xì)胞凋亡在組織的自動(dòng)平衡中起著重要作用。細(xì)胞凋亡是通過正常的方式在多細(xì)胞生物中消除不需要的、衰老的和受損的細(xì)胞，使機(jī)體細(xì)胞有絲的速度與凋亡的速度相平衡。任何情況的異常凋亡對機(jī)體都是有害的，都會(huì)產(chǎn)生不良后果，肝臟也不例外。目前人們認(rèn)識(shí)到異常凋亡在肝病的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用: 一方面，肝細(xì)胞過度凋亡可以導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟損傷; 另一方面，誘導(dǎo)凋亡機(jī)制的喪失可以導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。因此，對肝病患者需抑制肝細(xì)胞的凋亡，對

2、肝癌患者需選擇性的誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡。 1 細(xì)胞凋亡的定義和檢測方法定義細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)過程，是機(jī)體在生理或病理?xiàng)l件下受到刺激后，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生一系列形態(tài)和生化方面的改變而引起的程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡的特點(diǎn): 細(xì)胞變小，核固縮，細(xì)胞膜完整。核碎裂， DNA斷裂成 180 200bp，而且有蛋白質(zhì)和 mRNA的合成。膜包繞的凋亡小體形成。凋亡小體被鄰近巨噬細(xì)胞吞噬，這整個(gè)過程進(jìn)展非?？?，由數(shù)分鐘到幾個(gè)小時(shí) 1。一般周圍無炎癥反應(yīng)，但如果凋亡速度大于清除速度，則組織1 / 7結(jié)構(gòu)被破壞而且伴隨炎癥反應(yīng)2。與凋亡不同，壞死是一個(gè)被動(dòng)過程，壞死細(xì)胞變大，核溶解，膜通透性改變，線粒體結(jié)構(gòu)變化， DNA隨

3、機(jī)斷裂，其間沒有蛋白質(zhì)和mRNA的合成，壞死周圍有炎癥反應(yīng)。檢查方法對細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的觀察有HE染色光鏡觀察以及電子顯微鏡、相差顯微鏡、 共聚焦激光掃描顯微鏡檢查。對DNA降解片段的分析有瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA以及 SouthernBlotting方法。熒光標(biāo)記膜蛋白V的檢測 3。流式細(xì)胞技術(shù)可以對活體或已固定的凋亡細(xì)胞進(jìn)行定量分析。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記術(shù)。免疫組化。2 凋亡機(jī)制細(xì)胞凋亡的生化特點(diǎn)包括質(zhì)膜磷脂排列方向改變、細(xì)胞內(nèi)離子環(huán)境自穩(wěn)改變、蛋白酶和核酸內(nèi)切酶激活分別致細(xì)胞蛋白質(zhì)裂解和DNA斷裂、細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺、線粒體功能障礙、谷胱甘肽耗竭以及轉(zhuǎn)谷氨

4、酰胺酶激活1， 4。參與引發(fā)細(xì)胞凋亡的蛋白酶有多種，包括半胱氨酰天門冬氨酸特異蛋白酶家族成員和組織蛋白酶等 5。特別是 caspase 家族成員與細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切，至少有 14 種哺乳動(dòng)物 caspase 已獲克隆，但僅對 caspase-3 和 caspase-8 的功能有所了解。 caspase-8 在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮啟動(dòng)作用 ;caspase-3 在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮效應(yīng)作用 6。由于各 caspase 可相互激活，所以 caspase 蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡結(jié)構(gòu)改變的主要環(huán)節(jié)。線粒體功能障礙在細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制中起關(guān)鍵作用6，能促進(jìn)2 / 7線粒體功能障礙的因素很多，包括各種有害刺激

5、和信號(hào)傳遞過程，其中某些配體/ 受體相互作用最為重要。配體與靶細(xì)胞表面受體相結(jié)合，就導(dǎo)致復(fù)雜的多蛋白復(fù)合物形成，即將凋亡信號(hào)傳遞給效應(yīng)蛋白酶FLICE， FLICE 與 caspase-8相互反應(yīng)可激活caspase-8 ， caspase-8激活后就通過某些不明的機(jī)制引發(fā)線粒體功能障礙。線粒體功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞色素 C 釋放，細(xì)胞色素C 與凋亡激活因子-2相結(jié)合，使caspase-3激活 7。 caspase-3又激活DNA斷裂因子，導(dǎo)致靜息狀態(tài)的核酸內(nèi)切酶激活，最終引起DNA斷裂。從線粒體功能障礙到DNA斷裂，是細(xì)胞凋亡生化途徑的共同途徑。在肝細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制中，以 Fas 配體 /Fas

6、受體引發(fā)凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)研究得最多。此外，轉(zhuǎn)化生長因子1 及其受體 8、腫瘤壞死因子及其受體9在肝細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制中均起重要作用。細(xì)胞毒性T 細(xì)胞釋放的穿孔素和顆粒酶B也是介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的重要因素。DNA斷裂分兩型。首先發(fā)生的 DNA斷裂片段較大，為300kbp 或 500kbp 的倍數(shù)，此型DNA斷裂在細(xì)胞凋亡中發(fā)生頻繁，但并非都有。繼之DNA在核小體間斷裂成許多100 200bp 的小片斷，或呈 100200bp的倍數(shù)出現(xiàn)，稱為DNA斷裂梯狀模式10。兩型DNA斷裂是由不同的核酸內(nèi)切酶切割而形成的。也有人認(rèn)為這兩型DNA 斷裂可能單純代表一種動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象，即必須先有足夠大的 DNA片段形成，

7、方可發(fā)生小分子DNA斷裂，用凝膠電泳技3 / 7術(shù)、原位細(xì)胞化學(xué)技術(shù)或原位組織化學(xué)技術(shù)檢測DNA斷裂，是確定細(xì)胞凋亡的常用方法。細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因子是B細(xì)胞淋巴瘤 / 白血病 -2 蛋白家族的成員11， 12。 Bcl-2 ，通過抑制凋亡以延長細(xì)胞存活時(shí)間，是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞凋亡的一種強(qiáng)大抑制因子。 與 Bcl-2關(guān)系密切的同源物是Bcl-x ，有兩個(gè) RNA拼接變種，長 Bcl-X是較大的拼接變種， 短 Bcl-X是短拼接變種。 此外還發(fā)現(xiàn)一些其它的 Bcl-2同源物。 Bcl-2蛋白家族細(xì)胞凋亡抑制因子有:Bcl-2、 Bcl-XL 、 Bcl-W 、Bcl-XS 、 Mcl-1 、 Bf

8、l-1 、 Brag-1 、 Al;細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子有 :Bax 、Bak、 Bag、 Bid 、Bad、 Hrk、 Bik 。細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子和細(xì)胞凋亡抑制因子的相對優(yōu)勢決定著細(xì)胞對致凋亡刺激的反應(yīng)性。 Bcl-2 及其同源物主要定位于細(xì)胞膜，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核外膜和線粒體外膜。當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激時(shí)，Bcl-2可能通過防止線粒體功能障礙或阻斷線粒體細(xì)胞色素C、Apaf-2 釋放而抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-XL 似乎在不表達(dá)Bcl-2的肝細(xì)胞承擔(dān)這一功能。Bcl-2家族成員的表達(dá)在肝臟病和膽管細(xì)胞癌的發(fā)生中可能起重要作用，并參與調(diào)控肝再生反應(yīng)。 3 肝臟疾病中的凋亡現(xiàn)象近年來研究表明肝細(xì)胞的死亡方式

9、包括壞死和凋亡兩種。凋亡在肝臟疾病發(fā)展過程中的重要作用得到了人們的重視，現(xiàn)將有代表性的幾種肝臟疾病中的凋亡現(xiàn)象分述如下。病毒性肝炎Fas 系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在肝炎發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，在不同條件下，穿孔4 / 7素、顆粒酶、 TNF-、TGF-等也參與了肝細(xì)胞的凋亡 13，14。 1998 年 Galle等 15報(bào)道乙型肝炎時(shí)肝細(xì)胞Fas 表達(dá)增強(qiáng)，致敏的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞表達(dá)Fas 配基， CTL 經(jīng)過免疫途徑介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，參與病毒的清理和肝炎的病理生理過程。若該反應(yīng)過強(qiáng)，則可能誘發(fā)暴發(fā)性肝功能衰竭。這已經(jīng)得到大家的公認(rèn)。肝纖維化肝纖維化是慢性肝病共有的病理改變，有研究表明各種類型的肝

10、纖維化中都存在凋亡。肝星狀細(xì)胞的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。1998 年 Gong等報(bào)道 HSC向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變與sFasL 介導(dǎo)的凋亡增強(qiáng)相平行， Bcl-2和 Bcl-XL 在早期 HSC上的表達(dá)高于晚期HSC和 MFB， Bax 則相反。這說明調(diào)節(jié) HSC的凋亡易感性在肝纖維化發(fā)生機(jī)制中起重要作用。故認(rèn)為促進(jìn) HSC的凋亡有可能成為抗纖維化的措施之一。肝硬變凋亡現(xiàn)象在肝硬變病例的肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、單核細(xì)胞中普遍存在。1999 年 Frommel等 16對照研究了正常肝組織、丙型肝炎和肝硬變標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)對 Bcl-2 的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，肝硬變患者中表達(dá)最強(qiáng)，提出了一種解釋肝硬變患者中肝癌

11、高發(fā)生率的新機(jī)制。肝癌肝細(xì)胞癌形成過程中，不僅癌細(xì)胞異常增生，而且突變的細(xì)胞凋亡減少，肝癌細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)反應(yīng)明顯缺陷17， 1998年 Jodo 等報(bào)道肝癌血清中sFas 水平升高，切除腫瘤后， sFas水平即下降。一些抑癌劑如: 硒、類維生素A、化療藥物等可促進(jìn)鼠肝的潛在惡性細(xì)胞的凋亡，從而降低肝癌的發(fā)病率，5 / 7這從一個(gè)側(cè)面反映了凋亡在肝癌發(fā)病機(jī)制中的地位。1997 年CrasL 等報(bào)道在非基因毒性致癌物nafenopin所致的原發(fā)性肝癌中，正常肝細(xì)胞和肝腫瘤細(xì)胞都會(huì)受到抑制。當(dāng)nafenopin 的作用消失后，二者的凋亡都增加。后者的增殖率和凋亡率都高于前者。因此，采取促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋

12、亡的措施，將有可能成為未來治療肝癌的有效手段之一。酒精性肝病凋亡可發(fā)生在臨床和實(shí)驗(yàn)性的酒精性肝病中，酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的機(jī)制有: 表達(dá)細(xì)胞色素P4502E1 的 HepG2細(xì)胞暴露于花生四烯酸導(dǎo)致了脂質(zhì)過氧化和凋亡增加; 肝鐵水平的升高也促進(jìn)了脂質(zhì)過氧化和肝細(xì)胞凋亡發(fā)生; 酒精性肝病中TNF 及其受體的水平都升高，二者結(jié)合導(dǎo)致凋亡增加;肝細(xì)胞CD95L 的水平升高與肝組織中的CD95 結(jié)合誘導(dǎo)凋亡 ;CTL 細(xì)胞也通過 CD95與 CD95L的結(jié)合促進(jìn)凋亡的發(fā)生。自身免疫性肝病細(xì)胞凋亡對于清除潛在的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞以及免疫應(yīng)答后剩余的效應(yīng)細(xì)胞或突變細(xì)胞具有重要意義。若該機(jī)制發(fā)生障礙，則可能導(dǎo)致自身免疫