Western_Blot原理

1、Western Blot原理、顯色分類及操作步驟一、 原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢 測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移 到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保 持電泳分離 的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對 應(yīng)的抗體起免疫反 應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性 目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。既可以定性，又

2、可以半定量 的Western是初步鑒定蛋白質(zhì)最方便也是最通用的方法。western顯色的方法主要有以下幾種：放射自顯影 II.底物化學(xué)發(fā)光ECLft ft III.底物熒光ECFiv.底物DAB呈色現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目 前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECLo只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）:反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP,即發(fā)光，可使 膠片曝光，就可洗出條帶。二、操作步驟：（-）配膠1、注意一定要將玻璃板洗凈，最后用ddH20沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾 晾干。分離膠及

3、濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4C,可至 少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析 出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP （ 0.70.8:100,分離膠濃度越高AP 濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100 ）及TEMED （分離膠用0.4:1000, 15%的可用到 0.3:1000,濃縮膠用0.8： 1000）即可，如室溫較低可升髙10%AP及TEMED濃度到分子克隆建議濃度。2、封膠:灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度V10%時可用0.1%的SDS封，濃度10%時用水飽和

4、的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH20沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS, 目的是通過降低張力清除殘留水滴。片刻后倒掉SDS,將玻璃板倒立放置片刻控凈。3、灌好濃縮膠后1h拔除梳了，注意在拔除梳了時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進(jìn)入梳孔使梳 孔變形。撥出梳了后用ddH20沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正；若變形嚴(yán)重，可在去除殘膠后用較薄的梳了再次插入梳 孔后加水拔出。30min后即可上樣，長時間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內(nèi)部分了 的排列尚未完成。（

5、10%的AP最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如在4 C存放勿超過兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好棄掉）（二）樣品處理1 .培養(yǎng)的細(xì)胞（定性）:（1）去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗23遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。（2）對于 6 孔板來說每孔加 200-300 卩，1 60-80 C 的 1 Xoading buffer。（3）100 C, Imino（4）用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后在EP管中煮沸10min,期間vortex 2-3次。（5）用干凈的針尖挑絲，如有團(tuán)塊則將團(tuán)塊棄掉，如果沒有團(tuán)塊但有拉絲現(xiàn)象，則可以將EP管置于OC后在14000-160009離心2min,再次挑絲。若無團(tuán)塊也無絲狀物但溶液有些粘 稠，可

6、 通過使用1 ml注射器反復(fù)抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。（6）待樣品恢復(fù)到室溫后上樣。2培養(yǎng)的細(xì)胞（定量）:去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗23遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）O（2）加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上1O2Omin。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在 EP管后超聲（100-200W）3s, 2次。12OOOg 離心，4C, 2mino取少量上清進(jìn)行定量。將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣最好,剩余溶（溶于IXoading buffer）可以低溫儲存，-70C個月，20C 周，4C1吃 天，每次上 樣前98C, 3min。3. 組織：勻漿 對于

7、心肝脾腎等組織可每50-1 OOmg加1ml裂解液，肺100200mg加1ml裂解 液?？墒?動或電動勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。 12000g 離心，4C, 2min。取少量上清進(jìn)行定量。 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1 Xoading buffer ）可以低溫儲存，-70 C-個月，-20 C-周，4C1-2天，每次上樣 前 98C, Smirio（裂解液配方：Tris-CI （pH7.4） 20mM , EDTA 1 mM由于蛋白酶抑制劑可影響蛋白定量，且新鮮 蛋白很少降解，故可不加，如加按建議比例即可。提取磷酸

8、化的蛋白還需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM） o1 Xoading buffer 配方：10% 甘油，50mM Tris Gl （pH6.8） ,2%3毓基乙醇，0.20.5 顒酚藍(lán)， 2%或5%的SDSo Buffer可配成2 X5 X,注意SDS終濃度勿超過10%。對于心臟，肌肉等碎屑較多的組織可用5%的SDS,肝腎等組織2%即可。）（三）電泳1.上樣前將膠板下的氣泡趕走。IXIoading buffer 上樣,2. 所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣,樣品兩側(cè)的泳道用等體積的Marker也用1 XIoading buffer調(diào)整至與樣品等體積。2.以初始電壓為45V時的電流強度進(jìn)

9、行穩(wěn)流電泳，當(dāng)電壓達(dá)65V時改為穩(wěn)壓電泳。3在目的蛋白泳動至距膠下緣1cm以上結(jié)束。電泳液配方：Tris-base 3g, glycine 14.4g,0.1% SDS （10ml 10% SDS） /LTris-base 1.5g, glycine 7.2g,0.1% SDS （5ml 10% SDS ） /0.5L（四）轉(zhuǎn)膜 1 電泳結(jié)束前20分鐘左右戴上手套開始準(zhǔn)備：濕轉(zhuǎn)使用常規(guī)電轉(zhuǎn)液：Tris 3.0g, Gly 14.4g, M-OH 200ml,加去離了水至1,000ml。干轉(zhuǎn)則取此轉(zhuǎn)移液，每50ml加入10%SDS 180ulo浸泡NG膜：將NG膜平鋪于去離了水面，靠毛細(xì)作用自然

10、吸水后再完全浸入水屮lOmin以排除氣 泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVDF膜則在MOH中浸泡20min以上后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液屮。將濾紙也浸入 轉(zhuǎn)移液中。2, 取膠:將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠（以便以后雜其他感興趣的蛋白）左上切 角，在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側(cè)一張（干轉(zhuǎn) 每側(cè)三張）濾 紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分（尤其是干轉(zhuǎn)，以防止短 路）3.轉(zhuǎn)膜：濕轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)槽用去離了水淋洗晾干，加入1,000ml電轉(zhuǎn)液。將膠平鋪于海綿上，滴加少 許電轉(zhuǎn) 液再次驅(qū)趕氣泡，封緊后放入電轉(zhuǎn)槽，注意膜在正極一側(cè)。降溫，將電泳槽置于冰水 混合物中。

11、恒流WOmA過夜，或400mA, 4h。注意不同蛋白的要求不同。干轉(zhuǎn)：用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾 紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移l-S小時。負(fù)載電壓不宜超過1 V/cm2膠面積。電轉(zhuǎn)液配方：Tris-base 3g, glycine 14.4g, 200ml 甲醇 /IL（五）封閉及雜交1 .封閉：將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離了水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒于封閉液屮緩慢搖蕩一小 時。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離了水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。2.結(jié)合一抗：一抗的準(zhǔn)備：使用

12、反貼法時每張39cm2膜約需2ml 一抗稀釋液。反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液屮取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4C靜置過夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發(fā)。3. 洗滌:一抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10mino 4.結(jié)合二抗： 根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗，根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標(biāo)記的抗體，按相應(yīng)比例稀釋 （1:1000-1:10000）,室溫輕搖一小時。5.洗滌：二抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10minoPBS

13、T: 1 XPBSTTBS : Tris-HCI 20mM. pH 7.4 (25 0Tween-20 0.01% -0.02%NaCI150mMTween-20 0.05% 封閉液與抗體溶劑均為含5%脫脂奶粉的PBST或TTBS.臨用時取200ml PBST或TTBS加入lOg 脫脂奶粉即為封閉液。（六）發(fā)光鑒定一般使用辣根過氧化物酶HRP七CL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。1 . HRP-ECL 發(fā)光法：將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離了水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混 合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于

14、片盒屮，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸 入顯影 液中清水漂洗一下后放在定影液屮至底片完全定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker,進(jìn)行分 析與掃描。2. AP-NBT/BICP 顯色法：每片NBT/BICP可溶解于30ml水屮，使用前將一片分裝在30個EP管屮，每張3 X9cm的膜取 一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離了水稍加漂洗，濾紙貼角吸 干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報紙）遮擋光線，顯色后每10s 20s 觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時將膜揭起置去離了水屮漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與 掃描。背景深淺與一

15、抗的質(zhì)量及二抗的量有關(guān)，當(dāng)然如果暴光時間長達(dá)半小時，出現(xiàn)背景是正常的。二、注意事項：增強敏感性 若目的條帶未出現(xiàn)，或很淡，可試用以下方法增強發(fā)光強度：用清水漂洗膜數(shù)分鐘，重 加發(fā)光液進(jìn)行曝光，可延長曝光時間。將膜在PBST或TTBS屮洗滌30min或更長，期間至少換2 次液。封閉4060min一抗雜交，室溫37C1h會更強，但可能增加非特異條帶。PBST或TTBS洗膜20min,期間換2次液。二抗雜交，37C1h。PBST或TTBS洗膜20min,期間換2次液。發(fā)光鑒定。若條帶仍未出現(xiàn)或很淡，可以再用PBST或TTBS洗滌膜20min,期間換2次液。10. 三抗雜交，室溫1h。37C1h會更強，但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗，比如二 抗用羊抗兔，此時三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。11. PBST或TTBS洗滌膜20min,期間換2次液。12. 發(fā)光鑒定。一抗溶液屮加入0.2%疊氮鈉后可4C存放至少2周（一個月我也用過，沒問題，再長時間 還沒試） （七）NC膜的多次使用一張NC膜可使用多次，對多種蛋白進(jìn)行雜交，步驟與“七.增強敏感性”相近。如前次雜交 結(jié)果條帶距離本次雜交