最新PCR技術(shù)的過(guò)程和意義

1、PCR技術(shù)的過(guò)程和意義一. PCR技術(shù)的基本原理類似于DA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核昔 酸引物。PCR是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，是在模板DNA、引物和4種脫氧核昔酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ) 的寡核昔酸鏈引物經(jīng)“高溫變性一一低溫退火一-引物延伸三步反應(yīng)的多次循 環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得我們所需的大量的特 定基因片段。在環(huán)境檢測(cè)中，靶核酸序列往往存在于一個(gè)復(fù)雜的混合物如細(xì)胞提取液中, 且含量很低，對(duì)于探測(cè)這種復(fù)雜群體中的特異微生物或某個(gè)基因，雜交就顯得不 敏感。使用PCR技術(shù)可將靶序列放大

2、兒個(gè)數(shù)量級(jí)，再用探針雜交探測(cè)對(duì)被擴(kuò)增序 列作定性或定量研究分析微生物群體結(jié)構(gòu)。二. PCR技術(shù)的步驟PCR山變性一退火一延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成: 1、模板DXA的變性模板DNA經(jīng)加熱至93C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形 成的雙鏈DXA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;2、模板DXA與引物的退火(復(fù)性)模板DXA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55C左右，引物與模板DNA單鏈 的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;3、引物的延伸DNA模板一引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DM鏈互 補(bǔ)的

3、半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保 留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈乂可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24 分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)日的基因擴(kuò)增放大兒百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau) 所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。三. PCR技術(shù)的意義1、特異性強(qiáng)PCR反應(yīng)的特異性決定因素為: 引物與模板DNA特異正確的結(jié)合: 堿基配對(duì)原則: Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性; 靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵 循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDXA聚合酶耐高溫性，使反 應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（

4、復(fù)性）可以在較奇的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增 加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性 高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。2、靈敬度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克（pg=10-12）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（U g=-6）水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病的檢測(cè)中，PCR的靈敬度可達(dá)3個(gè)RFU（空斑形成單位）：在細(xì)菌學(xué)中最小檢 出率為3個(gè)細(xì)菌。3、簡(jiǎn)便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在24小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不

5、一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。4. 對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RXA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DM擴(kuò)增檢 測(cè)。四、PCR技術(shù)主要應(yīng)用的領(lǐng)域1、核酸的基礎(chǔ)研究：基因組克隆 2、不對(duì)稱PCR制備單鏈DM用于DM測(cè)序 3、反向PCR測(cè)定未知DXA區(qū)域 4、反轉(zhuǎn)錄PCR （RT-PCR）用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDXA5、熒光定量PCR用于對(duì)PCR產(chǎn)物實(shí)時(shí)監(jiān)控 6、cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù) 7、檢測(cè)基因的表達(dá) 8、醫(yī)學(xué)應(yīng)用：檢測(cè)細(xì)菌、病毒類疾?。辉\斷遺傳疾??；診斷腫瘤

6、；應(yīng)用于法醫(yī)物證學(xué)。五、關(guān)于RT-PCR4月17 0,在北京檢驗(yàn)檢疫局承擔(dān)的國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)U “禽流感 病WH7X9亞型雙重?zé)晒釸T-PCR定型技術(shù)研究”鑒定會(huì)上，專家組一致認(rèn)為：該 項(xiàng)U創(chuàng)新性地實(shí)現(xiàn)了對(duì)禽流感病毒H7N9亞型的一步快速定型，可在一次檢測(cè)中 確認(rèn)樣品中是否存在H7N9亞型禽流感病毒或其他H7亞型和N9亞型的禽流感病 毒;在通用性、特異性、靈敏性上，技術(shù)優(yōu)勢(shì)突出。專家組同意項(xiàng)日成果通過(guò)鑒 定，并建議在進(jìn)一步擴(kuò)大和完善動(dòng)物臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，盡快推廣應(yīng)用。RT-PCR 為反轉(zhuǎn)錄 RCR (reverse transcription PCR)和實(shí)時(shí) PCR (real tim

7、ePCR)共同的縮寫(xiě)。逆轉(zhuǎn)錄PCR,或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR),是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA,再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。RT-PCR技術(shù)靈敬而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量 和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RXA可以是總RNA、mRNA或體外 轉(zhuǎn)錄的RXA產(chǎn)物。無(wú)論使用何種RNA,關(guān)鍵是確保RNA中無(wú)RNA酶和基因組DNA 的污染。利用RT-PCR技術(shù)，也許在不久的將來(lái)，H79的快速診斷將成為一個(gè)非常容易的

8、問(wèn)題。中心小學(xué)四年級(jí)美術(shù)教學(xué)計(jì)劃總體思路浙美版四年級(jí)下冊(cè)美術(shù)教科書(shū)的編寫(xiě)，以國(guó)家一系列有關(guān)教育改革的文件, 特別是教育部基礎(chǔ)教育課程改革綱要(試行)為指針,以教育部制定并頒發(fā) 的義務(wù)教育美術(shù)課程標(biāo)準(zhǔn)為主要依據(jù)，打破過(guò)去以美術(shù)學(xué)科知識(shí)、技能為主 要目標(biāo)的教材體系結(jié)構(gòu)，構(gòu)建以促成美術(shù)素養(yǎng)的形成為核心，以探究性美術(shù)實(shí)踐 活動(dòng)為主線，以突岀美術(shù)教育視覺(jué)性、實(shí)踐性、人文性、愉悅性的單元結(jié)構(gòu)為基 收集于網(wǎng)絡(luò).如有g(shù)權(quán)請(qǐng)聯(lián)系管理員刪除本特征的美術(shù)教材新體系。本教材的編寫(xiě)注重學(xué)生審美感受和視覺(jué)經(jīng)驗(yàn)的培養(yǎng)，強(qiáng)調(diào)學(xué)生創(chuàng)新意識(shí)和實(shí) 踐能力的協(xié)調(diào)發(fā)展，以接近社會(huì),貼近學(xué)生,學(xué)以致用為原則，選擇符合四 年級(jí)小學(xué)生身心特

9、點(diǎn)的教學(xué)內(nèi)容設(shè)計(jì)課題。全冊(cè)共有19課分為10個(gè)隱性單元” 內(nèi)容涵蓋造型表現(xiàn)、 設(shè)計(jì)應(yīng)用、 欣賞評(píng)述、綜合探索4個(gè) 學(xué)習(xí)領(lǐng)域，其中造型表現(xiàn)及“設(shè)計(jì)，應(yīng)用占有較大比重，欣賞評(píng)述 大多隨堂教學(xué)，因而均分配在各課之中。本冊(cè)單元和課節(jié)教學(xué)內(nèi)容中，技能方面是按照由淺人深、循序漸進(jìn)的原則排 列的，但是也有并列的內(nèi)容。因此教師在安掃E教學(xué)時(shí)，課序可根據(jù)季節(jié)、學(xué)校及 學(xué)生的實(shí)際情況而作一定的調(diào)整。課時(shí)數(shù)只是一種建議,教師在教學(xué)時(shí)亦可根據(jù) 學(xué)生的實(shí)際水平和教學(xué)條件作適當(dāng)調(diào)整。二教學(xué)方法了解了本冊(cè)教材教學(xué)內(nèi)容安排的總體思路，接下來(lái)最要緊的就是如何教學(xué)。 那么如何以新課倉(cāng)1念指導(dǎo)本冊(cè)教學(xué)?編者認(rèn)為在教學(xué)中必須注意以下

10、幾個(gè)方 面：1 .注重審美能力的培養(yǎng)。在教學(xué)中,應(yīng)創(chuàng)造條件,多給學(xué)生感悟優(yōu)秀美術(shù)作品的機(jī)會(huì),引導(dǎo)學(xué)生展開(kāi) 想象，進(jìn)行比較。例如在上第9課奇妙的點(diǎn)彩時(shí)，先讓學(xué)生先欣賞點(diǎn)彩名家 作品。教師不要急于用簡(jiǎn)單的講解代替學(xué)生對(duì)點(diǎn)彩作品的觀察、理解、感悟,而 應(yīng)當(dāng)讓學(xué)生對(duì)藝術(shù)家如何通過(guò)奇妙的點(diǎn)彩方法描繪景物進(jìn)行t匕較、討論，從而引 導(dǎo)他們感受藝術(shù)表現(xiàn)的美，了解點(diǎn)彩畫(huà)法的不同表現(xiàn)形式及其美感，并讓他們多 談?wù)勛约旱母惺?，努力提高審美情趣? .重視創(chuàng)新精神和實(shí)踐能力的培養(yǎng)。學(xué)生創(chuàng)新思維苗子一定是在讓其不斷地探索和實(shí)踐中成長(zhǎng)和發(fā)展起來(lái)的。因 此，激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新精神和培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐能力是緊密聯(lián)系的。那么,應(yīng)該如何做呢？首先，要幫助學(xué)生獲得親身體驗(yàn),形成喜爰質(zhì)疑、樂(lè)于探究、努力求知的心 理傾向,激發(fā)創(chuàng)新的欲望。例如第5課時(shí)鐘造型設(shè)計(jì)應(yīng)抓住”時(shí)鐘造型設(shè)計(jì) 除了新穎、