負(fù)載肺癌抗原DC疫苗抗腫瘤免疫實(shí)驗(yàn)

1、負(fù)載肺癌抗原DC疫苗抗腫瘤免疫實(shí)驗(yàn)        【摘要】     目的 探討負(fù)載人肺癌細(xì)胞株A549凍融抗原DC疫苗體外抗腫瘤免疫效應(yīng)。方法 自臍血分離單核細(xì)胞，經(jīng)rhGMCSF、rhIL4和rhTNF誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)，負(fù)載人肺癌細(xì)胞株A549凍融抗原、LPS誘導(dǎo)成熟，利用免疫磁珠分選獲得功能性肺癌DC疫苗（UbDC/AgL），ELISA測定UbDC/AgL培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子濃度、LDH法測定特異性細(xì)胞殺傷（CTL）活性及MTT法檢測自身混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（A

2、MLR）。結(jié)果 UbDC/AgL細(xì)胞組IL1、IL12、IL6和IFN含量明顯高于UbDC/Ag和UbDC組(P<0.01)； UbDC/AgL疫苗細(xì)胞能有效誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL活性，對A549細(xì)胞有特異性殺傷作用（0.01），并能有效促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)論 負(fù)載腫瘤凍融抗原DC疫苗，能有效激活T淋巴細(xì)胞進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤特異性殺傷效應(yīng)。     【關(guān)鍵詞】  樹突狀細(xì)胞 腫瘤抗原 疫苗 抗腫瘤免疫        樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell,  DC）

3、作為機(jī)體最重要的專職性抗原提呈細(xì)胞，分化成熟與否直接影響T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)1。目前對DC疫苗的研究主要通過前體DC分選后誘導(dǎo)分化，獲得的DC處于未成熟或半成熟狀態(tài)2，而誘導(dǎo)分化后獲得的DC再進(jìn)行成熟性分選的研究未見報(bào)道。本研究采用細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，利用免疫磁珠分選獲得更純的負(fù)載抗原的功能性（成熟）DC疫苗，探討其抗腫瘤免疫效應(yīng)。    1  材料與方法    1.1  材料    1.1.1  臍血  足月正常分娩產(chǎn)婦臍血，每份100150ml，共約400ml。&#

4、160;   1.1.2  細(xì)胞株  人肺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株SMMC7721由本室傳代培養(yǎng)。    1.1.3  培養(yǎng)基及主要試劑  RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco)，重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGMCSF）、重組人腫瘤壞死因子（rhTNF）及重組人白細(xì)胞介素4（rhIL4）(RD Systems)，四甲基偶氮唑鹽（MTT）及絲裂霉素C（Mytomicin C）（Sigma），細(xì)胞因子培養(yǎng)基：10%胎牛血清（FBS）RPMI1640培養(yǎng)液中加入rhGMCSF 100ng/ml、r

5、hTNF  50ng/ml和rhIL4 50ng/ml。    1.1.4  檢測試劑盒  人IL6、IL12、TNF及IL1 ELISA Kit (RD Systems)；AntiFITC MicroBeads Kit磁珠分選試劑盒（Miltenyi biotec)。    1.1.5  熒光標(biāo)記單克隆抗體  抗人CD1aPE、抗人CD1aFITC、抗人CD40FITC、抗人CD86FITC、抗人HLADRFITC單克隆抗體（BD Biosciences Pharmingen）；抗人

6、CD83 FITC單克隆抗體（Immunotech）。    1.2  方法    1.2.1  負(fù)載腫瘤抗原DC疫苗的制備、誘導(dǎo)及分選  取臍血經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心、貼壁法制備UbDC，培養(yǎng)于細(xì)胞因子培養(yǎng)液中，同時(shí)收集懸浮細(xì)胞培養(yǎng)于含rhIL2 50ng/ml、10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)液作為臍血淋巴細(xì)胞；收集對數(shù)生長期A549細(xì)胞株，凍融法制備抗原；按細(xì)胞數(shù)101將UbDC細(xì)胞與A549細(xì)胞凍融抗原混合培養(yǎng)24h，分為兩組：（1）LPS刺激組：加入LPS（終濃度100ng/ml）誘導(dǎo)培養(yǎng)

7、48h后，運(yùn)用FITC熒光標(biāo)記的抗人CD83單克隆抗體，利用AntiFITC MicroBeads Kit免疫磁珠分選試劑盒，獲得的DC疫苗即UbDC/AgL；（2）LPS未刺激組：未加LPS誘導(dǎo)的DC疫苗UbDC/Ag。    1.2.2  細(xì)胞表面分子表達(dá)  分別收集UbDC/AgL、UbDC/Ag及UbDC細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記單克隆抗體，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子表達(dá)。    1.2.3  自身混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（AMLR）   經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液、采用貼壁法制備同份臍血淋巴細(xì)胞作

8、為反應(yīng)細(xì)胞；收集UbDC/AgL、UbDC/Ag、UbDC及A549細(xì)胞株，經(jīng)絲裂霉素C處理作為刺激細(xì)胞。按刺激細(xì)胞、反應(yīng)細(xì)胞分別為125、150、1100，均為三復(fù)孔，采用MTT法測定AMLR， Biorad 680型酶標(biāo)儀測定570nm吸光度（A）值，計(jì)算刺激指數(shù)SI。    刺激指數(shù)（SI）=實(shí)驗(yàn)組A570/對照組A570    1.2.4  體外誘導(dǎo)CTL活性測定  收集UbDC/AgL、UbDC/Ag、UbDC及A549凍融抗原，分別與同份臍血淋巴細(xì)胞按120比例加入6孔板，置37、5% CO2培養(yǎng)箱共孵

9、育24h，制備CTL（效應(yīng)細(xì)胞）；收集對數(shù)生長期A549和SMMC7721細(xì)胞株作為靶細(xì)胞；按不同效靶比251、501和1001，分別加入效應(yīng)細(xì)胞，均為三復(fù)孔，采用LDH法測定CTL活性，Biorad 680型酶標(biāo)儀測定570nm波長吸光度（A）值。CTL殺傷率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A570-效自然釋放組A570-靶自然釋放組A570）/（靶最大釋放組A570-靶自然釋放組A570）×100%    1.2.5  ELISA法測定細(xì)胞因子分泌  收集UbDC/AgL、UbDC/Ag、UbDC細(xì)胞，按5×105 /孔接種在6孔板內(nèi)，

10、置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，收集培養(yǎng)上清液，測定細(xì)胞因子IL1及 IL12含量；分別收集各組AMLR培養(yǎng)96h后的上清，測定細(xì)胞因子IL6及TNF濃度。    1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法    各組數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件作t檢驗(yàn)和方差分析。<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)果    2.1  肺癌DC疫苗鑒定    自臍血分離得單個(gè)核細(xì)胞于細(xì)胞因子培養(yǎng)液中， 第3天開始細(xì)胞表面出現(xiàn)長

11、短不一的樹棘狀突起， 細(xì)胞呈簇狀生長， 出現(xiàn)典型樹突狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變； FCM測定結(jié)果顯示UbDC/AgL細(xì)胞表面高表達(dá)CD40(70.25±5.8)%、 CD83(53.53±5.8)%、 CD86(67.56±6.5)%及HLADR(82.36±6.5)%分子； 通過CD83免疫磁珠陽性分選后獲得的細(xì)胞經(jīng)FCM檢測， 結(jié)果顯示90%以上表達(dá)CD1a， 見圖1。    圖1  UbDC/AgL經(jīng)CD83磁珠分選后FCM測定CD1a表達(dá)    2.2  刺激淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)&

12、#160;   MTT法測定不同刺激組UbDC/AgL、UbDC/Ag、UbDC及生理鹽水（NS）組AMLR，SI分別為3.91±0.18、1.41±0.17、1.83±0.21和1.21±0.15（與其他組比較<0.01）。    2.3  激發(fā)T淋巴細(xì)胞特異性殺傷作用    不同類型DC誘導(dǎo)CTL對靶細(xì)胞A549殺傷活性比較，見圖2。不同類型DC誘導(dǎo)CTL 對不同靶細(xì)胞A549、SMMC7721殺傷活性比較，見圖3。    圖

13、3  負(fù)載A549凍融抗原DC誘導(dǎo)    CTL對不同靶細(xì)胞的殺傷活性（%）    2.4  培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子濃度測定結(jié)果注：分別與UbDC/Ag 和UbDC 組比較，a<0.01,  b<0.01    AMLR培養(yǎng)96h后，不同刺激組細(xì)胞上清中IL6、TNF含量測定結(jié)果，見表2。    3  討論    樹突狀細(xì)胞作為機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)的始動(dòng)子和調(diào)節(jié)子，在機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)中極其重要，是近年來

14、免疫學(xué)研究中最活躍的領(lǐng)域。表2  各組AMLR培養(yǎng)96h后上清中細(xì)胞因子含量 注：分別與UbDC/Ag、UbDC及A549刺激組比較，# <0.01, *<0.01    體外誘生樹突狀細(xì)胞方法有多種，臍血來源豐富，已有利用臍血成功誘導(dǎo)DC的報(bào)道3。目前CD1a和CD83被廣泛作為人DC的相對特異性標(biāo)志，LPS作為免疫調(diào)節(jié)因子可以促進(jìn)DC成熟從而增強(qiáng)抗原提呈功能。本研究制備的UbDC/AgL細(xì)胞，經(jīng)FCM檢測顯示細(xì)胞表面高表達(dá)CD40、CD83、CD86及HLADR等DC成熟表面標(biāo)志，CD1a表達(dá)率90%是UbDC/AgL培養(yǎng)上清IL1、IL

15、12細(xì)胞因子含量明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組（P<0.01），表明DC在本細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)體系中能增殖生長，分選獲得的UbDC/AgL疫苗細(xì)胞純度更高、成熟度更高，能更好滿足實(shí)驗(yàn)研究的需要。    在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤抗原不能有效呈遞給T細(xì)胞是導(dǎo)致免疫逃逸的重要原因。同時(shí)在荷瘤機(jī)體中，由于存在抗原遞呈細(xì)胞的功能低下甚至缺陷，特別是DC在數(shù)量和功能的改變，可造成腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，導(dǎo)致腫瘤的形成和發(fā)展4。利用成熟DC負(fù)載腫瘤抗原制備出高效DC疫苗，是目前研究的熱點(diǎn)，也是能否誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL產(chǎn)生的關(guān)健所在5,6。目前已研究出多種DC負(fù)載抗原的方法7, 其

16、中凍融裂解法獲得腫瘤全抗原，無需明確腫瘤抗原具體的抗原成份，而有多種不同腫瘤抗原成分同時(shí)刺激DC，誘導(dǎo)出針對不同抗原決定簇的特異性CTL，該法具有潛在的優(yōu)勢。    本研究中DC經(jīng)抗原致敏誘導(dǎo)的CTL 殺傷作用隨著效靶比的增加而相應(yīng)提高, 顯示了殺傷活性的量效關(guān)系, 與國內(nèi)外研究結(jié)果一致8，9。本實(shí)驗(yàn)采用凍融法制備負(fù)載肺癌抗原UbDC/AgL疫苗細(xì)胞，經(jīng)AMLR刺激指數(shù)以及培養(yǎng)上清中IL6和TNF含量測定顯示，UbDC/AgL疫苗能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖及多種細(xì)胞因子分泌（<0.01）；同時(shí)UbDC/AgL對A549殺傷活性顯著高于無關(guān)靶細(xì)胞SMMC7721（

17、<0.01），并且UbDC/AgL疫苗細(xì)胞誘導(dǎo)CTL殺傷活性分別與UbDC/Ag、UbDC比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.01），隨著效/靶增加其殺傷活性增高，表明UbDC/AgL疫苗細(xì)胞能有效捕獲、提呈肺癌抗原并誘導(dǎo)出具有腫瘤特異性的CTLs，產(chǎn)生特異、高效抗腫瘤效應(yīng)，具有良好的臨床應(yīng)用前景。    （致謝:四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室毛詠秋老師、雷松老師。）    【參考文獻(xiàn)】  1 Dhodapkar MV, Steinman RM, Krasovsky J, et al. Antigen

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