固定化酶與固定化細(xì)胞ppt課件

1、第四章固定化酶與固定化細(xì)胞本章內(nèi)容o 酶的固定化o (1)為什么要固定化?o (2)怎樣固定化?(固定化方法)o (3) 固定化酶的特性o細(xì)胞的固定化o (1)細(xì)胞固定化所用的方法o (2) 固定化細(xì)胞的特性o輔酶的固定化什么是固定化酶？o指固定在一定載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)展催化反響的酶。一 酶的固定化直接利用微生物酶1 1不穩(wěn)定。在高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿下。不穩(wěn)定。在高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿下。2 2易失活。即使在最適宜的條件下反響。易失活。即使在最適宜的條件下反響。3 3回收困難。用適當(dāng)方法提取目的產(chǎn)物后，殘存酶回回收困難。用適當(dāng)方法提取目的產(chǎn)物后，殘存酶回 收困難。收困難。4 4反響速

2、度減慢。不容易和毒副分子和產(chǎn)物分別反響速度減慢。不容易和毒副分子和產(chǎn)物分別. .5 5經(jīng)濟(jì)上不合算。一次性反響后不能再次運(yùn)用。經(jīng)濟(jì)上不合算。一次性反響后不能再次運(yùn)用。妨礙了微生物酶的運(yùn)用和開(kāi)展。妨礙了微生物酶的運(yùn)用和開(kāi)展。研制固定化酶和固定化菌體研制固定化酶和固定化菌體(一)為什么要固定化?(一)為什么要固定化?o在一定程度上可以改善酶的穩(wěn)定性；o可以多次反復(fù)運(yùn)用，有利于采用延續(xù)操作工藝，從而使酶和細(xì)胞的運(yùn)用率提高，降低消費(fèi)本錢；o酶和細(xì)胞不混入產(chǎn)物，可精簡(jiǎn)產(chǎn)物分別工序。 (1)固定化在一定程度上可以改善酶的穩(wěn)定性o固定化添加了酶的耐熱性熱變性原理o固定化添加了酶對(duì)蛋白變性劑尿素，鹽酸胍等的抵

3、抗才干o固定化減少了蛋白酶的作用妨礙了活性部位的接近(2)固定化使酶和細(xì)胞的運(yùn)用率提高o江南大學(xué)的孫志浩經(jīng)過(guò)卡拉膠包埋的方法，使酶的反復(fù)利用30個(gè)批次后活性沒(méi)有明顯減少，大大促進(jìn)了酶的利用率，加速了工藝工業(yè)化進(jìn)程(3)可精簡(jiǎn)產(chǎn)物分別工序底物和產(chǎn)物更容易和酶分別(二) 怎樣固定化?(固定化方法) 固定化的第五種方法變性法o在不運(yùn)用載體的情況下，借助加熱、冰凍或-射線等物理手段，也可經(jīng)過(guò)添加檸檬酸、各種絮凝劑、交聯(lián)劑或變性劑處置，使細(xì)胞內(nèi)起破壞作用的蛋白酶變性、細(xì)胞構(gòu)造固定和菌體聚集成大顆粒到達(dá)固定化的目的。此法制備的細(xì)胞普通只用于完成單酶或少數(shù)幾種酶催化反響。 (1) 吸附法o物理吸附是經(jīng)過(guò)氫鍵

4、、疏水鍵和電子親和力等物理作用力將酶固定于不溶性載體的方法。常用的載體有高嶺土、皂土、硅膠、磷酸鈣膠、氧化鋁、微孔玻璃等無(wú)機(jī)吸附劑 o離子交換吸附是在適宜的pH和離子強(qiáng)度條件下，利用酶的側(cè)鏈解離基團(tuán)和離子交換劑的相互作用而到達(dá)固定化的一種方法。最常用的交換劑有CM纖維素、DEAE纖維素、DEAE葡聚糖凝膠等。 蛋白質(zhì)濃度：假設(shè)吸附劑的量固定，隨蛋白質(zhì)濃度添加，吸附量也添加，蛋白質(zhì)濃度：假設(shè)吸附劑的量固定，隨蛋白質(zhì)濃度添加，吸附量也添加，直至飽和。直至飽和。 pH：影響載體和酶的電荷變化：影響載體和酶的電荷變化,從而影響酶吸附。從而影響酶吸附。離子強(qiáng)度：多方面的影響，普通以為鹽阻止吸附。離子強(qiáng)度

5、：多方面的影響，普通以為鹽阻止吸附。溫度：蛋白質(zhì)往往是隨溫度上升而減少吸附。溫度：蛋白質(zhì)往往是隨溫度上升而減少吸附。載體：蛋白質(zhì)在固體載體上的吸附速度要比載體：蛋白質(zhì)在固體載體上的吸附速度要比 小分子慢得小分子慢得 同時(shí)對(duì)于非多孔性載體，那么顆粒越小吸附力越同時(shí)對(duì)于非多孔性載體，那么顆粒越小吸附力越 強(qiáng)。多孔性載體，強(qiáng)。多孔性載體，要思索吸附對(duì)象的大小要思索吸附對(duì)象的大小 和總吸附面積的大小。和總吸附面積的大小。 影響酶蛋白在載體上吸附程度的要素影響酶蛋白在載體上吸附程度的要素吸附法特點(diǎn)o優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，處置條件溫暖，酶的高級(jí)優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，處置條件溫暖，酶的高級(jí)構(gòu)造和活性中心不易破壞，有利于

6、制備高活構(gòu)造和活性中心不易破壞，有利于制備高活性酶性酶o缺陷：載體與酶的結(jié)合力較弱，在高離子強(qiáng)缺陷：載體與酶的結(jié)合力較弱，在高離子強(qiáng)度下酶易從載體上零落度下酶易從載體上零落吸附法制備的工藝o水相固定化法 這是最常見(jiàn)的吸附固定化方法，即將酶溶解于緩沖液中，參與載體，振蕩或攪拌一定時(shí)間后，抽濾、洗滌、冷凍枯燥即可得固定化酶 o載體外表涂布法 將酶溶入少量緩沖液中，參與載體，混合均勻，冷凍枯燥可得固定化酶。此法相當(dāng)于直接將酶涂布于載體上，防止了水相固定化中酶的大量流失o溶劑沉淀法 即在低溫下向含有載體的脂肪酶液中參與酶的有機(jī)溶劑作沉淀劑(如丙酮)使酶析出，沉淀在載體外表。此法所得固定化酶酶活性較高，

7、載體性質(zhì)對(duì)固定化無(wú)明顯影響，但酶在載體外表分布不均勻 吸附法制備的工藝o游離固定化法 將具有一定親水性的載體分散于疏水溶劑中，另將酶粉溶入少量緩沖液的酶液參與，振蕩可攪拌一定時(shí)間后，便得固定化酶。其原理是：親水性載體可在其外表構(gòu)成一層水膜，酶分子不溶于溶劑，只能存在于這層水膜中，因此可以完全被固定化 o微晶體法 將可結(jié)晶的物質(zhì)和酶溶液混合在一同，然后滴入親水有機(jī)溶劑中，當(dāng)可結(jié)晶物質(zhì)結(jié)晶析出時(shí)，酶就有規(guī)那么吸附在晶體外表上o電堆積法。在酶溶液中放置兩個(gè)電極，在電極臨近參與載體，通電后，酶移向電極，并堆積到載體外表的固定化方法。采用這種方法時(shí)需事先確定載體和酶在電場(chǎng)中能否會(huì)分解和失活。在堆積過(guò)程中

8、和酶活性、穩(wěn)定性有關(guān)的某些離子假設(shè)發(fā)生移除、損漏，那么就必需即時(shí)補(bǔ)充、替代。(2) 共價(jià)結(jié)合法 o借助共價(jià)鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)或細(xì)胞外表基團(tuán)如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基等和載體的功能基團(tuán)進(jìn)展偶聯(lián)以到達(dá)固定化目的方法。o此法得到的固定化酶結(jié)合結(jié)實(shí)、穩(wěn)定性好、利于延續(xù)運(yùn)用，因此它是目前運(yùn)用最多的一類固定化酶的方法。共價(jià)偶聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)：得到的固定化酶結(jié)合結(jié)實(shí)、穩(wěn)定性共價(jià)偶聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)：得到的固定化酶結(jié)合結(jié)實(shí)、穩(wěn)定性好、利于延續(xù)運(yùn)用。好、利于延續(xù)運(yùn)用。共價(jià)偶聯(lián)法的缺陷：載體活化的操作復(fù)雜，反響條件猛共價(jià)偶聯(lián)法的缺陷：載體活化的操作復(fù)雜，反響條件猛烈，需求嚴(yán)厲控制條件才可以獲得較高活力的固定化酶。

9、烈，需求嚴(yán)厲控制條件才可以獲得較高活力的固定化酶。同時(shí)共價(jià)結(jié)合會(huì)影響到酶的空間構(gòu)象，從而對(duì)酶的催化同時(shí)共價(jià)結(jié)合會(huì)影響到酶的空間構(gòu)象，從而對(duì)酶的催化活性產(chǎn)生影響?；钚援a(chǎn)生影響。共價(jià)偶聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)、缺陷共價(jià)偶聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)、缺陷共價(jià)結(jié)合法example纖維素纖維素+ +鹽酸甲醇鹽酸甲醇CMCCMC甲酯甲酯肼肼CMCCMC酰肼酰肼CMCCMC疊氮化物疊氮化物NH2NH2酶酶亞硫酸鈉亞硫酸鈉鹽酸鹽酸固定化酶固定化酶 CH2CO-CH2CO-NHNH酶酶CMCCMCCH2COOHCH2COOH制備酰肼制備酰肼疊氮化物疊氮化物羧甲基纖維素疊氮法制備固定化葡萄糖淀粉酶程序羧甲基纖維素疊氮法制備固定化葡萄糖淀粉酶程

10、序l重氮法l溴化氰法l烷基化三氯勻三嗪l疊氮法A重氮法o反響式及原理B 疊氮法o例o用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶，步驟如下：o 酯化o 肼解o 疊氮化o(4) 偶聯(lián)B 疊氮法o對(duì)含有羧基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團(tuán)的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后與酶偶聯(lián) 。與酶中的氨基、羥基、巰基反響。C烷基化反響法o含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進(jìn)展活化，構(gòu)成含有鹵素基團(tuán)的活化載體。與酶中的氨基、羥基、巰基反響。D硅烷化法o多孔玻璃特點(diǎn)：o 機(jī)械強(qiáng)度好，外表積大。o 耐有機(jī)溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長(zhǎng)等。 D硅烷化法o普通常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。D硅烷化

11、法D硅烷化法D硅烷化法E 溴化氰法o本方法主要用溴化氰CNBr活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)大孔網(wǎng)狀構(gòu)造。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前運(yùn)用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。E 溴化氰法與酶中的氨基反響 1) 載體的物化性質(zhì)要求載體親水載體的物化性質(zhì)要求載體親水(防止吸附防止吸附)，并且有，并且有一定的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，同時(shí)具備在溫暖條件下與酶一定的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，同時(shí)具備在溫暖條件下與酶結(jié)合的功能基團(tuán)。結(jié)合的功能基團(tuán)。2) 偶聯(lián)反響的反響條件必需在溫暖偶聯(lián)反響的反響條件必需在溫暖pH、中等離子強(qiáng)、中等離子強(qiáng)度和低溫的緩沖溶液中。度和

12、低溫的緩沖溶液中。3) 所選擇的偶聯(lián)反響要盡量思索到對(duì)酶的其它功能所選擇的偶聯(lián)反響要盡量思索到對(duì)酶的其它功能基團(tuán)副反響盡能夠少。基團(tuán)副反響盡能夠少。4) 要思索到酶固定化后的構(gòu)型，盡量減少載體的空要思索到酶固定化后的構(gòu)型，盡量減少載體的空間位阻對(duì)酶活力的影響。間位阻對(duì)酶活力的影響。共價(jià)偶聯(lián)法固定化酶的幾個(gè)影響要素共價(jià)偶聯(lián)法固定化酶的幾個(gè)影響要素共價(jià)偶聯(lián)法勝利的關(guān)鍵在于載體的選擇、偶聯(lián)反響、偶聯(lián)反響過(guò)程中的活性維護(hù)和偶聯(lián)量的多少。此法固定化細(xì)胞的報(bào)導(dǎo)甚少，它的開(kāi)展有賴于新的溫暖偶聯(lián)方法和生物相容性好的偶聯(lián)試劑的開(kāi)發(fā) (3) 交聯(lián)法o利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、或酶分子與惰性蛋白間進(jìn)展交聯(lián)反

13、響以制備固定化酶的方法。o常用的試劑有戊二醛、甲苯二異氰酸酯、乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物等。o交聯(lián)法操作簡(jiǎn)便，但交聯(lián)反響往往比較猛烈，許多酶容易在固定化過(guò)程中失活，酶回收率不高。 交聯(lián)法o發(fā)生作用的氨基酸殘基：發(fā)生作用的氨基酸殘基：o 酪氨酸的酚基酪氨酸的酚基o 胱氨酸的胱氨酸的SH巰基巰基o N末端的末端的a氨基氨基o常用的雙功能或多功能試劑：常用的雙功能或多功能試劑：o 戊二醛戊二醛o 聚甲叉雙碘乙酰胺聚甲叉雙碘乙酰胺o 雙重氮聯(lián)苯胺雙重氮聯(lián)苯胺共價(jià)交聯(lián)法的四種方式共價(jià)交聯(lián)法的四種方式1酶直接交聯(lián)法酶直接交聯(lián)法 在酶液中參與適量多功能試劑，在酶液中參與適量多功能試劑，使其構(gòu)成不溶性衍生物。固定化

14、依賴使其構(gòu)成不溶性衍生物。固定化依賴于酶與試劑的濃度、溶液于酶與試劑的濃度、溶液pH和離子和離子強(qiáng)度、溫度和反響時(shí)間之間的平衡。強(qiáng)度、溫度和反響時(shí)間之間的平衡。 操作簡(jiǎn)單，但是缺乏選擇性，活力操作簡(jiǎn)單，但是缺乏選擇性，活力回收往往不高?；厥胀桓?。2 酶輔助蛋白交聯(lián)：酶輔助蛋白交聯(lián)： 當(dāng)可得到的酶量有限，可以運(yùn)用第二個(gè)當(dāng)可得到的酶量有限，可以運(yùn)用第二個(gè)“載體載體蛋白來(lái)添加蛋白質(zhì)濃度，從而使酶與惰性蛋白蛋白來(lái)添加蛋白質(zhì)濃度，從而使酶與惰性蛋白共交聯(lián)的方法。共交聯(lián)的方法。 這種這種“載體蛋白即輔助蛋白，可以是白蛋白、載體蛋白即輔助蛋白，可以是白蛋白、明膠、血紅蛋白等。明膠、血紅蛋白等。3吸附交聯(lián)

15、法：吸附交聯(lián)法：此法先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀此法先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹(shù)脂或其他大孔型離子交換樹(shù)脂上，再用酚醛樹(shù)脂或其他大孔型離子交換樹(shù)脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)，用此法所得固定化戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)，用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。酶也可稱為殼狀固定化酶。4載體交聯(lián)法：載體交聯(lián)法： 用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)化學(xué)修飾用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)化學(xué)修飾高聚物載體，而其中的另一部分功能基團(tuán)偶聯(lián)高聚物載體，而其中的另一部分功能基團(tuán)偶聯(lián)酶蛋白。酶蛋白。 (4)包埋法o經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)的方法將酶或細(xì)胞限制在一定的空間范圍內(nèi)，底物和產(chǎn)物能自在分散，從而到達(dá)

16、反復(fù)利用生物質(zhì)的一種固定化方法。此方法是固定化細(xì)胞的最主要方法。o包埋法可分為格型包埋和微囊型包埋。前者是將酶或細(xì)胞分散包埋在聚合物的膠格中，如聚丙烯酰胺凝膠、卡拉膠、聚乙烯醇、海藻酸鈣等；后者是將一定量的酶或細(xì)胞包在半透膜內(nèi)，如尼龍膜、醋酸纖維、NaCS/PDMDAAC膠囊等。此法制備條件溫暖、生物相容性好，但僅可用于低分子量的底物，且常受分散限制。 微膠囊特點(diǎn)o微囊直徑幾微米幾微囊直徑幾微米幾百微米。百微米。o低分子底物可以自在低分子底物可以自在經(jīng)過(guò)并進(jìn)入微囊內(nèi)。經(jīng)過(guò)并進(jìn)入微囊內(nèi)。o酶本身是高分子物質(zhì)酶本身是高分子物質(zhì)不能經(jīng)過(guò)微囊而被留不能經(jīng)過(guò)微囊而被留在微囊中，在微囊中，o外部的蛋白分解

17、酶、外部的蛋白分解酶、抗體等高分子物質(zhì)也抗體等高分子物質(zhì)也無(wú)法進(jìn)入微囊內(nèi)無(wú)法進(jìn)入微囊內(nèi)EEECo-enzymesSubstratesProductsEnzymes Macromoleculesoutside the capsulesCapsule membrane包埋法的優(yōu)點(diǎn)包埋法的優(yōu)點(diǎn)在于它是一種反響條件溫暖、很少改動(dòng)酶構(gòu)造但是又在于它是一種反響條件溫暖、很少改動(dòng)酶構(gòu)造但是又較結(jié)實(shí)的固定化方法。較結(jié)實(shí)的固定化方法。 包埋法的缺陷包埋法的缺陷是只需小分子底物和產(chǎn)物可以經(jīng)過(guò)高聚物網(wǎng)架分散，是只需小分子底物和產(chǎn)物可以經(jīng)過(guò)高聚物網(wǎng)架分散，對(duì)那些底物和產(chǎn)物是大分子的酶并不適宜。這是由于對(duì)那些底物和產(chǎn)物

18、是大分子的酶并不適宜。這是由于高聚物網(wǎng)架會(huì)對(duì)大分子物質(zhì)產(chǎn)生分散阻力導(dǎo)致固定化高聚物網(wǎng)架會(huì)對(duì)大分子物質(zhì)產(chǎn)生分散阻力導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)行為改動(dòng)，使活力降低。酶動(dòng)力學(xué)行為改動(dòng)，使活力降低。包埋法的優(yōu)點(diǎn)、缺陷包埋法的優(yōu)點(diǎn)、缺陷微囊化制備方法微囊化制備方法微囊法主要將酶封裝在膠囊、脂質(zhì)體和中空纖維中。膠囊和脂質(zhì)體主微囊法主要將酶封裝在膠囊、脂質(zhì)體和中空纖維中。膠囊和脂質(zhì)體主要用于醫(yī)學(xué)治療，中空纖維主要適于工業(yè)運(yùn)用要用于醫(yī)學(xué)治療，中空纖維主要適于工業(yè)運(yùn)用 。微囊制備方法微囊制備方法1界面沉淀法是一種簡(jiǎn)單的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在界面沉淀法是一種簡(jiǎn)單的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有機(jī)相

19、的界面上溶解度較低而構(gòu)成的皮膜將酶包埋。水相和有機(jī)相的界面上溶解度較低而構(gòu)成的皮膜將酶包埋。2界面聚合法有機(jī)溶液中添加外表活性劑使之乳化構(gòu)成油包水構(gòu)造界面聚合法有機(jī)溶液中添加外表活性劑使之乳化構(gòu)成油包水構(gòu)造,再用單體分子在界面聚合再用單體分子在界面聚合,到達(dá)包埋目的的一種方法。到達(dá)包埋目的的一種方法。 3原位聚合原位聚合 沒(méi)有界面發(fā)生的聚合反響成膜沒(méi)有界面發(fā)生的聚合反響成膜A A 乳化分散：取含有酶和親水性單體的水溶液，在不乳化分散：取含有酶和親水性單體的水溶液，在不溶于水的有機(jī)溶媒中充分乳化。溶于水的有機(jī)溶媒中充分乳化。B B 外表聚合：將含有疏水性單體的有機(jī)溶媒參與到上外表聚合：將含有疏水

20、性單體的有機(jī)溶媒參與到上述乳化液中，發(fā)生聚合反響，生成的薄膜把酶包圍起述乳化液中，發(fā)生聚合反響，生成的薄膜把酶包圍起來(lái)構(gòu)成微型膠囊球。來(lái)構(gòu)成微型膠囊球。C C 清洗：反響完成后，用有機(jī)溶劑洗去未反響的剩清洗：反響完成后，用有機(jī)溶劑洗去未反響的剩余單體余單體1 1界面聚合法界面聚合法微膠囊的制備example)-原位聚合o NaCS (Sodium Cellulose Sulphate纖維素硫酸鈉 o oPDMDAAC (Polydimethyldiallylammonium Chloride，聚二甲基二烯丙基氯化銨o這兩種物質(zhì)均是能溶于水的聚電解質(zhì)。NaCS是聚陰離子化合物，PDMDAAC為聚

21、陽(yáng)離子化合物，當(dāng)這兩種帶不同電荷的物質(zhì)混合時(shí)，在兩者的界面發(fā)生絡(luò)合反響，生成多聚電解質(zhì)復(fù)合體PEG，Polyelectrolyte Complexe，構(gòu)成了一層半透膜。 OO*O*HOOHCH2OSO3-Na+HOH2CnOHHOH2CH2C*N+H3CCH3*Cl-nNaCS-PDMDAAC微膠囊制備的反響過(guò)程表示圖 NaCSPDMDAACPDMDAACroNaCSrorirarb固定化酶的制法及其特性比較固定化酶的制法及其特性比較 特性特性制備方法制備方法共價(jià)鍵共價(jià)鍵結(jié)合法結(jié)合法離子離子結(jié)合法結(jié)合法物理物理吸附法吸附法包埋法包埋法制法制法難難易易易易難難酶活力酶活力高高高高高高低低底物特異

22、性底物特異性易變易變不變不變不變不變不變不變結(jié)合才干結(jié)合才干強(qiáng)強(qiáng)中中弱弱弱弱再生再生不可不可能夠能夠能夠能夠不可不可交聯(lián)法交聯(lián)法難難中中易變易變強(qiáng)強(qiáng)不可不可固定化酶的保管方法運(yùn)用時(shí)固定化酶的保管是一個(gè)很重要的環(huán)節(jié)。運(yùn)用時(shí)固定化酶的保管是一個(gè)很重要的環(huán)節(jié)。 1 1 真空冷凍枯燥保管長(zhǎng)期保管真空冷凍枯燥保管長(zhǎng)期保管 2 2 低溫保管低溫保管 3 3 多孔玻璃的無(wú)機(jī)質(zhì)載體比纖維素等的有機(jī)質(zhì)載體多孔玻璃的無(wú)機(jī)質(zhì)載體比纖維素等的有機(jī)質(zhì)載體 更適于長(zhǎng)期保管。更適于長(zhǎng)期保管。 4 4 無(wú)機(jī)質(zhì)載體中，以重氮結(jié)合法制備的固定化酶具無(wú)機(jī)質(zhì)載體中，以重氮結(jié)合法制備的固定化酶具 有較好的保管性。有較好的保管性。(三)

23、 固定化酶特性固定化后酶會(huì)發(fā)生()載體酶 構(gòu)象變化微擾 立體屏蔽酶特異性(Km)穩(wěn)定性以及最適溫度()載體底物 分配效應(yīng)分散效應(yīng)最適pH變化立體屏蔽：是由于載體的孔隙太小，或是由于固定化的方式與位置不當(dāng)，給酶的活性中心或調(diào)理中心呵斥了空間妨礙，因此底物與效應(yīng)物無(wú)法和酶接觸，從而影響酶活性的一種效應(yīng)。這種效應(yīng)也難于定量描寫(xiě)，多見(jiàn)于包埋，吸附法或共價(jià)偶聯(lián)法。微擾：是由于載體的親水、疏水性質(zhì)和介質(zhì)的介電常數(shù)等直接影響酶的催化才干或酶對(duì)效應(yīng)物作出反響才干的一種效應(yīng)。這種效應(yīng)更難于定量描寫(xiě)和預(yù)見(jiàn)，但是經(jīng)過(guò)改動(dòng)載體與介質(zhì)的性質(zhì)可作出判別與調(diào)理?？臻g妨礙效應(yīng)空間妨礙效應(yīng)(立體屏蔽立體屏蔽) 固定化之后，由于

24、酶的空間自在度遭到限制固定化之后，由于酶的空間自在度遭到限制(由于載由于載體的空隙太小，或者固定化方式與位置不當(dāng)，給酶體的空隙太小，或者固定化方式與位置不當(dāng)，給酶的活性部位呵斥了空間屏障的活性部位呵斥了空間屏障)，使酶分子的活性基團(tuán)，使酶分子的活性基團(tuán)不易于底物或效應(yīng)物接觸，影響酶分子的分子活性不易于底物或效應(yīng)物接觸，影響酶分子的分子活性中心對(duì)底物的定位作用中心對(duì)底物的定位作用,所呵斥的對(duì)固定化酶的活力所呵斥的對(duì)固定化酶的活力的影響效應(yīng)，被稱為空間妨礙效應(yīng)。的影響效應(yīng)，被稱為空間妨礙效應(yīng)。 分配效應(yīng)分配效應(yīng) 由于載體和底物的性由于載體和底物的性質(zhì)差別引起了微環(huán)境質(zhì)差別引起了微環(huán)境和宏觀環(huán)境之間

25、的性和宏觀環(huán)境之間的性質(zhì)不同。微環(huán)境是在質(zhì)不同。微環(huán)境是在固定化酶附近的部分固定化酶附近的部分環(huán)境，而將主體溶液環(huán)境，而將主體溶液稱為宏觀環(huán)境。由這稱為宏觀環(huán)境。由這種不同呵斥的底物、種不同呵斥的底物、產(chǎn)物和各種效應(yīng)物在產(chǎn)物和各種效應(yīng)物在兩個(gè)環(huán)境之間的不同兩個(gè)環(huán)境之間的不同分配，被稱為分配效分配，被稱為分配效應(yīng)。應(yīng)。 分散限制效應(yīng)分散限制效應(yīng) 酶固定化使生物催化反響從均相轉(zhuǎn)化為多相，于是產(chǎn)生了分散阻力：酶固定化使生物催化反響從均相轉(zhuǎn)化為多相，于是產(chǎn)生了分散阻力： 1 1、外分散阻力是底物從宏觀環(huán)境向酶顆粒外表傳送過(guò)程中的一種分散限制效應(yīng)，、外分散阻力是底物從宏觀環(huán)境向酶顆粒外表傳送過(guò)程中的一種

26、分散限制效應(yīng)，它發(fā)生在反響之前，發(fā)生在固定化顆粒周圍的液膜層。它會(huì)使底物在固相酶周圍構(gòu)它發(fā)生在反響之前，發(fā)生在固定化顆粒周圍的液膜層。它會(huì)使底物在固相酶周圍構(gòu)成濃度梯度，經(jīng)過(guò)添加攪拌速度和底物流速的方法可以減少外分散效應(yīng)。成濃度梯度，經(jīng)過(guò)添加攪拌速度和底物流速的方法可以減少外分散效應(yīng)。 2 2內(nèi)分散阻力是指底物分子到達(dá)固相酶外表后傳送到酶活性部位時(shí)的一種分散阻力，內(nèi)分散阻力是指底物分子到達(dá)固相酶外表后傳送到酶活性部位時(shí)的一種分散阻力，它與催化反響同時(shí)進(jìn)展。它與催化反響同時(shí)進(jìn)展。 載體小而彎曲的細(xì)孔是產(chǎn)生內(nèi)分散阻力的要緣由。因此運(yùn)用低分子量底物，小的粒載體小而彎曲的細(xì)孔是產(chǎn)生內(nèi)分散阻力的要緣由。

27、因此運(yùn)用低分子量底物，小的粒徑、載體孔盡能夠大而直且相互連通，或僅僅將酶固定在載體外表都可以降低這種徑、載體孔盡能夠大而直且相互連通，或僅僅將酶固定在載體外表都可以降低這種內(nèi)分散阻力。內(nèi)分散阻力。 固定化酶的特性詳細(xì)表如今如下特性：穩(wěn)定性(普通升高) 1)固定化后的酶與載體多點(diǎn)銜接，可防止酶分子 伸展變形。 2)抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性最適溫度變化普通升高，但有些酶依然會(huì)降低，如烷基化固定的氨基?；缸钸mpH受底物影響和載體影響發(fā)生偏挪動(dòng)底物特異性由于空間妨礙妨礙底物接觸而影響Km值固定化酶最適pH變化o底物分散限制如酸性底物停留在酶分子周圍，使酶外表pH降低，需求升高溶液pH值才干到達(dá)原來(lái)

28、最優(yōu)pH氫離子o底物滯留在酶外表降低宏觀H+(升高pH)固定化酶最適pH變化o載體分配效應(yīng)陰離子載體要到達(dá)自在酶外表氫離子程度最優(yōu)pH,必需升高宏觀溶液中OH濃度,減少分配進(jìn)入載體的氫離子二 細(xì)胞的固定化o細(xì)胞固定化所用的方法o固定化細(xì)胞的特性1 1、可增殖，細(xì)胞密度大，可獲得高度密集而體積小的消費(fèi)菌集合體、可增殖，細(xì)胞密度大，可獲得高度密集而體積小的消費(fèi)菌集合體2 2、發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)運(yùn)用或延續(xù)運(yùn)用。、發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)運(yùn)用或延續(xù)運(yùn)用。3 3、發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分別純化。、發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分別純化。4 4、有利于需求輔酶和多酶系統(tǒng)才干進(jìn)展的反響。、有利于需求輔酶和多酶系統(tǒng)才干進(jìn)展的反響。(一) 細(xì)胞固定化所用的方法o吸附法根據(jù)細(xì)胞特性選擇吸附載體o (1) 酵母負(fù)電荷多孔陶瓷和塑料o (2) 霉菌菌絲體長(zhǎng)金屬網(wǎng)絲o (3) 植物細(xì)胞中孔纖維外壁o (4) 動(dòng)物細(xì)胞貼壁細(xì)胞容器壁細(xì)胞固定化所用的方法o包埋法 o包埋本質(zhì)上是酶周圍聚合(銜接)的過(guò)程o(1)溫度誘導(dǎo)的交聯(lián)o瓊