家族性高膽固醇血癥患者低密度脂蛋白受體基因新突變位點(diǎn)的鑒定

1、生理學(xué)報(bào) Acta Physiologica Sinica, October 25, 2004, 56 (5: 566-572566研究 論文Received 2004-04-30 Accepted 2004-09-01*Corresponding author. Tel: +86-571-87236500; Fax: +86-571-87236889; E-mail: chenjz01家族性高膽固醇血癥患者低密度脂蛋白受體基因新突變位點(diǎn) 的鑒定劉燕榮 1, 陶謙民 1, 陳君柱 1,*, 陶 明 2, 郭曉綱 1, 尚云鵬 1, 朱建華 1, 張芙榮 1, 鄭良榮 1, 王興祥 11浙江大學(xué)

2、醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科暨心血管病研究所 , 杭州 310003; 2中國(guó)科學(xué)院華大基因和生物信息研究所 , 北京 100023摘 要 : 家族性高膽固醇血癥 (hypercholesterolemia familial, FH是由于低密度脂蛋白受體 (low density lipoprotein receptor, LDLR基因突變導(dǎo)致的常染色體顯性遺傳性疾病 , 臨床上表現(xiàn)為多發(fā)黃色瘤、高水平血漿 LDL 、早發(fā)性冠心病及有陽(yáng)性家族史。 本研究通過臨床癥狀結(jié)合血脂測(cè)定診斷出一個(gè) FH 家系 , 其純合子 FH 患者的血漿總膽固醇水平高達(dá) 19.05 mmol/L, LDL達(dá) 17.06

3、mmol/L, 并有黃色瘤 ; 而雜合子 FH 患者的血漿總膽固醇水平為 7.96 mmol/L, LDL為 5.55 mmol/L, 并有心絞痛癥狀和黃色 瘤。我們對(duì)該 FH 家系患者 LDLR 基因的 PCR 擴(kuò)增 DNA 片段進(jìn)行測(cè)序 , 發(fā)現(xiàn)純合子 FH 患者 LDLR 基因 Exon4區(qū)域內(nèi)發(fā)生了 GAG683GCG 突變 , 即編碼 LDLR 第 683位的谷氨酸被丙氨酸替換 , 而雜合子 FH 患者該位點(diǎn)呈現(xiàn)雜合突變。此基因型與臨 床診斷遺傳譜完全一致。同時(shí) , 利用獲得 Epstein-Barr(EB病毒轉(zhuǎn)化型人永生淋巴細(xì)胞株 (EBV-Ls與熒光探針 DiI 標(biāo)記的 LDL

4、結(jié)合反應(yīng) , 再通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示 , 具有功能性 LDLR 的 EBV-Ls 細(xì)胞比例 , 在純合子 FH 患者 (7.02%和雜合子 FH 患 者 (62.64%均比健康對(duì)照者 (84.69%低 , 純合子 FH 患者 LDLR 活性僅為健康對(duì)照者的 8.29%、而雜合子 FH 患者 LDLR 活性 約為健康對(duì)照者的 73.96%, 前者呈現(xiàn)非常顯著的降低。這些 EBV-Ls 細(xì)胞 LDLR 的功能變化分析 , 有力地支持了該 FH 家系 的臨床診斷和 DNA 測(cè)序結(jié)果。經(jīng)查閱最新的 UMD-LDLR 完全版證實(shí) , 本研究發(fā)現(xiàn)鑒定的 GAG683GCG 突變是人 LDLR 基因

5、的新突變位點(diǎn)。關(guān)鍵詞: 家族性高膽固醇血癥 ; 低密度脂蛋白受體 ; Epstein-Barr病毒 ; 永生化淋巴母細(xì)胞 ; 流式細(xì)胞儀 ; 突變位點(diǎn) 中圖分類號(hào): Q48; R54Identification of a novel mutation at the point of low density lipoproteinreceptor gene from a subject with familial hypercholesterolemiaLIU Yan-Rong1, TAO Qian-Min1, CHEN Jun-Zhu1,*, TAO Ming2, GUO Xiao-Gang1

6、, SHANG Yun-Peng1, ZHUJian-Hua 1, ZHANG Fu-Rong1, ZHENG Liang-Rong1, WANG Xing-Xiang11Department of Cardiovascular Diseases, the First Affiliated Hospital, Medical School of Zhejiang University, Hangzhou 310003,China; 2 Institute of Gene & Biology Information, China Academy of Sciences, Beijing

7、100023, ChinaAbstract: Family hypercholesterolemia (FH is a genetic disorder caused by mutation in the low density lipoprotein receptor (LDLR gene.It is characterized by a high concentration of low density lipoprotein (LDL, which frequently gives rise to tendon xanthenes andpremature coronary artery

8、 disease. We studied a FH family ,which was diagnosed by clinical features and blood lipid tests. The Totalcholesterol level of the family was 19.05 mmol/L and the LDL level was 17.06 mmol/L in the proband homozygous FH subjects, while thetotal cholesterol was 7.96 mmol/L and LDL was 5.55 mmol/L in

9、the heterozygous FH subjects. DNA segments amplified with PCR weresequenced in heterozygous and homozygous FH patients. Two novel identical mutation alleles of GAG683GCG, which caused an aminoacid change from Glu to Ala, were detected in Exon4 of LDL receptor gene in homozygous proband. DNA sequenci

10、ng revealed that theprobands parents were heterozygotes with the same mutational alleles as the proband. These results are in coincidence with the clinicaldiagnoses. Moreover Epstein-Barr virus transformed lymphocytes (EBV-Ls were derived by routine virus infection transformingprotocol. The cells bo

11、unded with the fluorescently conjugated LDL were measured by fluorescence flow cytometry. The ratios offunctional LDLR in EBV-Ls originated from homozygous FH, heterozygous FH and normal control were 7.02%, 62.64% and 84.69%,567劉燕榮等 :家族性高膽固醇血癥患者低密度脂蛋白受體基因新突變位點(diǎn)的鑒定respectively. As a result, the homozy

12、gous FH patients LDLR had 8.29% and the heterozygous FH patients LDLR had 73.96% of the activity of the control. It is apparent that LDL receptor activity of homozygous FH subject is significantly lower than normal control. The data from fluorescence flow cytometry analysis of EBV-Ls strongly suppor

13、t the clinical diagnoses and the results of DNA sequencing.In accordance with the updated version of UMD-LDLR, the mutant GAG683GCG in Exon4 of LDLR gene which we have identified is a novel mutation of the LDLR gene in human with hypercholesterolemia.Key words: familial hypercholesterolemia; lour de

14、nsity lipoprotein receptor; Epstein-Barr virus; immortalized lymphoblastoid; fluorescence flow cytometry家族性高膽固醇血癥 (familial hypercholesterolemia, FH , 是最典型的常染色體顯性遺傳的單基因疾病之 一,是由于低密度脂蛋白受體基因 (low density lipo-protein receptor, LDLR突變引起的 1。雜合子 FH 患者 , 是由于從其父母的一方遺傳獲得一個(gè)異常的 LDLR 基因,其體內(nèi)細(xì)胞的功能性 LDLR 還可存留 50%左

15、右;而純合子 FH 患者,從其父母雙方遺傳 獲得異常的 LDLR 基因, 故體內(nèi)細(xì)胞功能性 LDLR 很 低或缺失 2,3。在 55歲之前早發(fā)的心血管病例中,有 5%的患者是雜合子的 FH ,而 50%的 FH 患者在 60歲之前就死于心肌梗死 4。為了研究中國(guó) FH 患者中 LDLR 基因的突變情況, 我們應(yīng)用 DNA 測(cè)序法對(duì) 1個(gè)臨床診斷 FH 家系的 3個(gè) 成員的 LDLR 基因進(jìn)行分析, 并利用流式細(xì)胞儀測(cè)定 了該 FH 家系來(lái)源的 EBV-Ls 細(xì)胞 LDLR 與熒光探針 DiI 標(biāo)記 LDL 的結(jié)合功能, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)了影響功能的 LDLR 基因新突變位點(diǎn)。1 材料和方法1.1 材料

16、1.1.1 細(xì)胞株 絹猴細(xì)胞株 B95-8用于制備 Epstein-Barr(EB病毒,均為北京華大基因免疫細(xì)胞所贈(zèng)送。 1.1.2 試劑 淋巴細(xì)胞分離液為上海恒信化學(xué)試劑有 限公司產(chǎn)品 (批號(hào) 20020828 。 Tris 為上海思吉生物制 品有限公司進(jìn)口分裝 (批號(hào) 010912 。環(huán)胞霉素A (CyA(批號(hào) 093K4020 、植物凝集素 PHA(批號(hào) 082K7450 均為美國(guó) Sigma 公司產(chǎn)品。健康成人血漿 購(gòu)自浙江省中心血站。 3-(4,5-二甲基噻唑 -2-2,5-二 苯基四氮唑溴鹽 (MTT、 Hepes 為 AMRESCO 分裝 (批 號(hào) 0481B50 。 D-Han

17、ks 平衡鹽溶液、 DiI 為美國(guó) Biotium 公司產(chǎn)品 (批號(hào) 970807 。胎牛血清購(gòu)自美國(guó) GIBCO 公司 (批號(hào) 1175736 。 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) GIBCOBRL 公司 (批號(hào) 1165062 。 二甲基亞砜 (分析純 為江蘇鴻聲化工廠產(chǎn)品 (批號(hào) 20000914 。甲醛溶液 (分析純 購(gòu)自浙江巨化集團(tuán)有限公司試劑廠 (批號(hào) 20010701 。青霉素鈉鹽購(gòu)自石家莊制藥集團(tuán)有限公 司 ( 批號(hào) 030705-3 。鏈霉素購(gòu)自華北制藥股份有限 公司 (批號(hào) 020710 。馬鈴薯淀粉購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥上海 化學(xué)試劑公司 (批號(hào) 20001204 。 NaBr(分析純 購(gòu)自

18、上 海化學(xué)試劑有限公司 (批號(hào) 001203 。1.2 方法1.2.1 LDLR基因序列分析 研究對(duì)象:臨床診斷為 雜合子 FH 、純合子 FH 患者及健康對(duì)照各 1人。臨 床診斷為 FH 者的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)為 5: 成人膽固醇 > 7.8 mmol/L, 16歲以下兒童膽固醇 > 6.7 mmol/L或成人 LDL-C > 4.9 mmol/L,以及患者或親屬有黃色瘤。其 中,膽固醇 > 16 mmol/L并有黃色瘤者診斷為純合 子 FH ,未達(dá)純合子標(biāo)準(zhǔn)者診斷為雜合子 FH 。 LDLR 基因片段制備。 采用鹽析法提取人外周血 白細(xì)胞 DNA 作為模板,利用人工合成各種引

19、物對(duì), 分別進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 LDLR 基因 5'UTR 、啟動(dòng)子區(qū)、 18個(gè)外顯子和 3'UTR 區(qū)等 DNA 片段。 PCR 擴(kuò)增條件 為:預(yù)變性 92 , 1 min; 變性 92 , 10 s; 退火 62 , 30 s, 延伸 72 , 1 min; 循環(huán) 35次 ; 后延伸 72 , 5 min。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定, 并用 Millipore 方法 純化獲得各種 LDLR 基因片段。LDLR 基因片段的序列測(cè)定。上述制備的各種 LDLR 基因片段, 送中國(guó)科學(xué)院華大基因和生物信息 研究所測(cè)序。 所有步驟及條件均按照該所使用的 377測(cè)序儀的要求進(jìn)行

20、, 并用 377測(cè)序儀自帶序列讀取軟 件讀取序列,應(yīng)用 DNASTAR 應(yīng)用軟件包中 SeqMan 軟件進(jìn)行分析。1.2.2 EB病毒永生化人淋巴母細(xì)胞株的建立 參考 Lombardi 的方法 6并稍作改進(jìn)。從雜合子 FH 、純合 子 FH 及健康對(duì)照者,各抽取其外周靜脈血 5 ml,用 密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞,提取中間層白細(xì) 胞, PBS 洗滌 3次后,重懸于含有 20%胎牛血清的 2 ml轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液,其含有 1 ml EB病毒 (106 U/ml、生理學(xué)報(bào) Acta Physiologica Sinica, October 25, 2004, 56(5: 566-572568PHA(1

21、%和環(huán)胞霉素 A(2 µg/ml。 懸浮細(xì)胞在 24孔板 (1 ml/孔 培養(yǎng) 3 d后,加入 1 ml新鮮的不含 PHA 及 環(huán)胞霉素 A 的完全培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng) 1周后細(xì)胞明顯 增多,再轉(zhuǎn)入 25 ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng),并觀察至細(xì)胞成 懸浮狀生長(zhǎng),進(jìn)而及時(shí)換液繼續(xù)培養(yǎng) 2周后凍存。凍 存細(xì)胞再經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng),以確證成功建立 EB 病毒永生 化人淋巴母細(xì)胞株 (Epstein-Barr transformed cell lines,EBV-Ls 細(xì)胞。1.2.3 EBV-Ls細(xì)胞 LDLR 功能分析 低密度脂蛋白 及無(wú)脂血清 (lipoprotein deficient serum, LP

22、DS的制 備。取健康人空腹血清 , 用超速離心法制備 LDL(密 度調(diào)節(jié)為 1.041.06 g/ml及無(wú)脂血清 (密度調(diào)節(jié)為 1.21g/ml, 通過瓊脂糖凝膠電泳法鑒定證明無(wú)其他組分污 染后 , 以 Lowry 法測(cè)定其濃度 7。 采用熒光探針 DiI 標(biāo)記 LDL 。利用以上制備的健 康人 LDL, 進(jìn)行熒光探針 DiI 標(biāo)記 , 反應(yīng)同文獻(xiàn)報(bào)道 8, 熒光探針 DiI 標(biāo)記 LDL(DiI-LDL濃度為 400 µg/ml。 EBV-Ls 細(xì)胞與 DiI-LDL 的結(jié)合反應(yīng)。 參考文獻(xiàn)進(jìn) 行 9: (1取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 EBV-Ls 細(xì)胞 , 懸浮于 RPMI1640液 (含

23、10% LPDS并調(diào)整細(xì)胞濃度為 0.5×106 /ml, 于 12孔板 (2.0 ml/孔 培養(yǎng) 72 h后 , 離心取沉淀細(xì)胞; (2本 底組沉淀細(xì)胞 (1.0×106, 直接用 3%的甲醛固定 15min ; (3實(shí)驗(yàn)組沉淀細(xì)胞 (1.0×106 , 懸于 950 µl RPMI1640液 (含 10% LPDS, 并加入 50 µl DiI-LDL(終 濃度為 20 µg/ml, 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 4.5 h后 , 4下放置 30 min,離心取沉淀細(xì)胞 , 用 3%的甲醛固定 15 min; (4用 D-Hanks 液洗滌并重懸

24、甲醛固定細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)懸浮于 D-Hanks 液的甲醛固 定 EBV-Ls 細(xì)胞熒光信號(hào),以 10 000個(gè)細(xì)胞為基數(shù), 通過含有熒光細(xì)胞所占的百分比例 10來(lái)了解 FH 家系 結(jié)合 DiI-LDL 的能力。根據(jù)本底組細(xì)胞測(cè)定值,通 過軟件設(shè)置顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的 M1、 M2結(jié)果,在 M1范圍的細(xì)胞不具有 LDLR 結(jié)合配體 LDL 活性,而在M2范圍的細(xì)胞則具有 LDLR 結(jié)合配體 LDL 活性, 并 且 M2越靠右邊顯示 LDLR 結(jié)合配體 LDL 活性越高。 健康對(duì)照者、雜合子 FH 和純合子 FH 患者的樣本 EBV-Ls 細(xì)胞均 3次重復(fù)測(cè)量后取平均值。2 結(jié)果2.1 FH家

25、系的臨床診斷我們通過臨床癥狀結(jié)合血脂測(cè)定 (表 1, 對(duì)一 FH 家系 (圖 1 進(jìn)行了較詳細(xì)的分析研究。發(fā)現(xiàn)該家系的 先證者 1的血漿總膽固醇水平高達(dá) 19.05 mmol/L,LDL 達(dá) 17.06 mmol/L, 并有皮膚黃色瘤 , 臨床診斷為 純合子 FH 患者。而該家系的 1的血漿總膽固醇水 平為 7.96 mmol/L, LDL為 5.55 mmol/L, 臨床有心絞痛 的癥狀及有腱黃色瘤 , 故臨床診斷為雜合子 FH 患者。2.2 FH家系 LDLR 基因的新突變位點(diǎn)測(cè)定進(jìn)而,對(duì)臨床診斷為純合子 FH 患者、雜合子 FH 患者的 LDLR 基因進(jìn)行 DNA 測(cè)序研究。根據(jù)人 LD

26、LR 基因結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)合成了 11對(duì)引物 (圖 2 ,其詳 細(xì)序列見表 2。分別以健康對(duì)照者、純合子 FH 和表 1. FH家系患者及健康對(duì)照者的臨床情況及血脂測(cè)定情況Table 1. Genernal characterisitics and the serum lipid levels of the FH family and the unrelated healthy subjectsSubject Sex Age (year Total cholTG LDL cholHDL cholAngina pectorisSkin or tendon xanthomata 1M 56 7.962.

27、89 5.55 1.08 + Tendon 2F 50 6.840.63 5.88 0.67 - - 1M 26 19.051.59 17.06 1.26 + Skin Heathy subjectM 20 3.900.58 1.87 1.54 - -TC, total cholesterol; TG, triglyceride; HDL-C, HDL cholesterol; LDL-C, LDL cholesterol. M, male; F, female. Concentration unitis mmol/L.圖 1. 臨床診斷的 FH 家系圖譜。Fig. 1. Pedigree o

28、f the family with FH diagnosed by clinic features.Circles and squares represent females and males, respectively. Fullshade and half shade represent homozygotes and heterozygote,respectively. Open circles and squares represent normal femalesand males, respectively. Arrow indicates the proband.569劉燕榮等

29、 : 家族性高膽固醇血癥患者低密度脂蛋白受體基因新突變位點(diǎn)的鑒定 雜合子 FH 患者的 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,并分 離獲得了 LDLR 基因 5'UTR 、啟動(dòng)子區(qū)、 18個(gè)外顯子 和 3'UTR 區(qū)等 DNA 片段。 LDLR 基因 Exon4區(qū)域的 DNA 測(cè)序結(jié)果 (圖 3 顯示,與健康對(duì)照者的相比 (圖 3A , FH 患者 1的 LDLR 基因 Exon4內(nèi)發(fā)生了 GAG683GCG 的純合突變 (圖 3C ,即編碼 LDLR 第 683位的谷氨酸被丙氨酸替換, 而 FH 患者 1或 2則為雜合突變 (圖 3B ,并且在 30個(gè)正常對(duì)照組中 均未發(fā)現(xiàn)以上突

30、變。 FH 患者的上述測(cè)定基因型結(jié) 果,與臨床診斷該 FH 家系遺傳譜 (圖 1 完全一致。 經(jīng)查閱最新的 UMD-LDLR 完全版,未見該位點(diǎn)突變 報(bào)道, 說明 GAG683GCG 突變是人 LDLR 基因的新突 變位點(diǎn)。2.3 FH家系 LDLR 的功能變化分析已有研究表明, EBV-Ls的 LDLR結(jié)合 LDL 配基 活性,可通過流式細(xì)胞儀 (FFC測(cè)定,并且能反映 體內(nèi)細(xì)胞 LDLR 的功能作用。因此,我們分別進(jìn)行 了健康對(duì)照者、 雜合子 FH 和純合子 FH 患者的 EB 病毒轉(zhuǎn)化型人永生淋巴細(xì)胞株 (EBV-Ls的建立、保存 和復(fù)蘇培養(yǎng),成功地獲得了相應(yīng)的各種 EBV-Ls 細(xì)胞

31、(結(jié)果未顯示 。并且,進(jìn)一步利用獲得的這些 EBV-Ls 細(xì)胞,與熒光探針 DiI 標(biāo)記 LDL(DiI-LDL進(jìn)行結(jié) 合反應(yīng),然后通過流式細(xì)胞儀測(cè)定含有熒光細(xì)胞所 占的比例來(lái)間接了解 FH 家系 EBV-Ls 細(xì)胞 LDLR 的功表 2. LDLR基因 DNA 直接測(cè)序的引物序列 Table 2. Primers for direct DNA sequecing of LDLR genesAmplified sequence Forward primers(5'-3' Reverse primers(3'-5'5'UTR-Exon1CTTCACCGGA

32、GACCCAAATA TTTCCCTTAAATCCCTCAGACTC Exon2-3GACACAGGAAACGTGGTCAGT ACAAACCCGAAGAGGTAGCAC Exon4CAACCCAAAATAAGGACAGCA TTTCTTGGCATGTTGTTGGA Exon5-6CTCAAGCAGTTGGAACCACA TTCCCAAAACCCTACAGCAC Exon7-8GTAGGGGCCCGAGAGTGAC GATGAAACTCCCCCACCACT Exon9-10ACCCTGCAGGATGACACAAG CAGTTCCTGAAGCTCCTTCCT Exon11-12TTCTTCCAG

33、AATTCGTTGCAC TGTGTCTATCCGCCACCTAAG Exon13-14CCTGTGTCTCATCCCAGTGTT ACAAAGGGGACCATTTCCTC Exon15CCTCCCAAGGTCATTTGAGA GACTCCATCTCGTGACCAAAA Exon16CTCTGCCTGCTCCA TTTCTTG AGCTCCACATCCTCCATCTGA Exon17-18ACCAGGAGTCAAGGTTATGGTACGTCTCAGGAAGGGTTCTGGGC圖 2. 人 LDLR 基因物理圖譜Fig. 2. Physical map of human LDLR genes.

34、The horizontal lines mean introns and the panes mean exons. The numbers of 118 are thesequence numbers of exons. The forward arrows indicate the forward primers and the reverse ones indicate reverse primers.能變化情況。流式細(xì)胞儀以 10 000個(gè)細(xì)胞為基數(shù)測(cè) 定,并根據(jù)本底組細(xì)胞測(cè)定值而通過軟件設(shè)置顯示 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞 M1、 M2結(jié)果。在 M1 范圍的細(xì)胞不具 有 LDLR 結(jié)合配體 LDL

35、 活性,而在 M2范圍的細(xì)胞 則具有 LDLR 結(jié)合配體 LDL 活性。圖 4是健康對(duì)照 者、 雜合子 FH 和純合子 FH 患者的 EBV-Ls 細(xì)胞樣本圖 3. DNA序列分析。 A 、 B 、 C 分別為健康對(duì)照者、雜合 子 FH 患者、純合子 FH 患者 LDLR 基因 Exon4部分的 DNA 測(cè) 序結(jié)果Fig. 3. Sequence analysis of LDLR genes. A , B and C shows the resultsof the partial nucleotide sequences of exon4 of the LDLR gene in theregi

36、on surrounding the GAG 683 GCG mutation amplified from thehealthy control, heterzygous FH subject and homozygous FH subject,respectively. The position of mutation is marked with an arrow inthe sequence. It was A in the healthy control, C in the homozygousFH subject,while heterozygote with A and Cin

37、the heterozygous FHsubject.生理學(xué)報(bào) Acta Physiologica Sinica, October 25, 2004, 56(5: 566-572 5703次重復(fù)測(cè)量的平均值結(jié)果,顯示具有功能性 LDLR的 EBV-Ls 細(xì)胞比例,純合子 FH 患者 (7.02%和雜合子 FH 患者 (62.64%均比健康對(duì)照者 (84.69%低,表明純合子 FH 患者 LDLR 活性僅為健康對(duì)照者的 8.29%、而雜合子 FH 患者 LDLR 活性約為健康對(duì)照者的 73.96%,前者呈現(xiàn)非常顯著降低。這些EBV-Ls 細(xì)胞 LDLR 的功能變化分析,有力地支持了該 FH 家系

38、的臨床診斷和 DNA 測(cè)序結(jié)果。3 討論家族性高膽固醇血癥是 LDLR 基因突變導(dǎo)致的顯性遺傳疾病,在人群中并不罕見。目前的研究發(fā)現(xiàn),雜合子 FH 的人群發(fā)病率為 1/500,而純合子 FH為 1/1000000,中國(guó)人群的發(fā)病率略高于此 1。目前最大的 FH 數(shù)據(jù)庫(kù) (http:/www.ucl.ac.uk/fh/已顯示世界各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn) LDLR 基因突變的種類已有 840種,其中 490種是新發(fā)現(xiàn)的突變,包括點(diǎn)突變、小片段或大片斷缺失、插入或重排,其中點(diǎn)突變占所有突變的 90% 11。 LDLR 基因位于人類第 19號(hào)染色體 , 長(zhǎng) 45 kb, 編碼 860個(gè)氨基酸的 LDLR 前體。根

39、據(jù)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系, LDLR 可分為 5個(gè)功能區(qū)。而LDLR 基因突變對(duì) LDL 代謝途徑的影響, 主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面 12: (1 LDLR合成不完整; (2 LDLR合成后不能轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體進(jìn)行修飾; (3 LDLR結(jié)合 LDL 的能力降低; (4 LDLR與 LDL 結(jié)合后不能轉(zhuǎn)移入細(xì)胞; (5 LDLR能與 LDL 結(jié)合并移入細(xì)胞,但在內(nèi)移小泡中不能與 LDL 分離,參加下一輪的循環(huán)。外顯子 2-6編碼受體蛋白的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域每一重復(fù)片段的 C 端存在一個(gè)三肽保守序列 ,與結(jié)合 LDL 配體的能力密切相關(guān)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,本研究 FH 家系的 LDLR 基因突變位點(diǎn)位于 E

40、xon4, 表 明其編碼突變 LDLR 的功能缺陷可能在于 LDL 配體結(jié) 合功能障礙 13,14。由于 LDLR 基因突變導(dǎo)致 LDLR 功能受損, 故 FH 的臨床最主要表現(xiàn)為血漿中高水平的 LDL ,進(jìn)而出 現(xiàn)早發(fā)性冠心病及黃色瘤等。純合子 FH 患者癥狀 重,發(fā)病年齡較早,往往在兒童時(shí)期發(fā)病。而雜 合子 FH 患者癥狀相對(duì)較輕,成人后發(fā)病多見,而 且雜合子 FH 患者由于其飲食和個(gè)人生活方式的不同 其臨床表現(xiàn)各異, 且與家族性 apo-B 基因缺陷的患者 在臨床上很難區(qū)別,唯有 DNA 測(cè)序才能明確 LDLR 圖 4. 流式細(xì)胞儀測(cè)定分析。 A 、 B 、 C 分別為健康對(duì)照者、 雜合

41、子 FH 和純合子 FH 患者的 EBV-Ls 細(xì)胞 LDLR 結(jié)合功能測(cè) 定 3次重復(fù)平均值結(jié)果Fig.4. Analysis of fluorescence flow cytometry measurement results. A , B and C showed the LDLR function of the EBV-Ls originated from the unrelated healthy subject, the heterozygous FH patient and ho-mozygous FH patient. 10 000 cells were counted in

42、each sample throughout 3 repeats. According to the measurement of the basic cells we set M1 and M2. No functional LDLR was detected in the cells in the range of M1, while in the range of M2 functional LDLR was detected; and the righter the cells are located in M2, the higher reactivity was shown in

43、the low density lipoprotein receptor.劉燕榮等: 家族性高膽固醇血癥患者低密度脂蛋白受體基因新突變位點(diǎn)的鑒定 571 基因突變位點(diǎn) 15 ，并且通過檢測(cè) LDLR 功能變化， 認(rèn)為出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因部分在于參加研究的正常人的 LDLR 活性受多種復(fù)雜因素的調(diào)控。同時(shí), 他們指出 LDLR 活性為正常人的 70% 以下為明顯降低, 而在 70%80% 屬臨界范圍22。本工作流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié) 果表明, 雜合子 FH 患者 LDLR 活性下降在臨界范圍, 而純合子 FH 患者的 LDLR 活性非常明顯下降, 說明 LDLR 的功能變化與其基因突變的結(jié)果一致。 綜上所

44、述，我們認(rèn)為 L D L R 基因 E x o n 4 內(nèi) GAG683GCG 突變，是導(dǎo)致本研究 FH 家系患病的根 本原因，理由在于： (1突變導(dǎo)致密碼子的改變，從 而造成氨基酸的變異，以至于引起低密度脂蛋白受 體結(jié)構(gòu)和功能的改變； (2基因突變位點(diǎn)在家系中的 分布與臨床判斷的疾病分布規(guī)律基本符合； (3在對(duì) 照組中沒有發(fā)現(xiàn)同樣的突變； 4 流式細(xì)胞儀測(cè)定 ( LDLR 的活性支持該突變導(dǎo)致本研究 FH 家系疾病。 * * * * * 以確定 LDLR 基因的新突變位點(diǎn)。 目前檢測(cè) LDLR的方法很多， 其中流式細(xì)胞儀是 一種新的簡(jiǎn)單的方法。它是以高能量激光照射高速 流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染

45、色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量 其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞(微 粒的性狀進(jìn)行定性或定量分析的技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用 熒光探針 DiI標(biāo)記LDL與細(xì)胞表面有功能的LDLR結(jié) 合， 進(jìn)而通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光來(lái)間接評(píng)價(jià)LDLR 的功能。而常規(guī)的 I 標(biāo)記的 LDL 配體 - 受體結(jié)合分 析法，因其使用同位素和操作過程繁瑣且費(fèi)時(shí)、昂 貴，故在臨床上難以廣泛開展。 被用于 LDLR 功能研究的細(xì)胞很多, 最直接的是 肝細(xì)胞，但是由于肝細(xì)胞取材困難, 很少被應(yīng)用于實(shí) 驗(yàn)工作。一般常用的細(xì)胞有: 皮膚成纖維細(xì)胞、PHA 刺激的人淋巴細(xì)胞及 EB 病毒轉(zhuǎn)化的人淋巴母細(xì)胞。 EB 病毒轉(zhuǎn)化的人淋巴母細(xì)胞,

46、由于其具有永生化、 復(fù)制時(shí)間短、懸浮生長(zhǎng), 且具有基因型和表現(xiàn)型穩(wěn)定 的特點(diǎn), 被廣泛地應(yīng)用于研究 LDLR 功能16-18。EB 病 毒是由 172 kb 的 dsDNA 組成，可表達(dá)近 100 種病毒 蛋白，其中6 種核蛋白具有啟動(dòng)和維持B淋巴細(xì)胞生 長(zhǎng)的功能，它們是 EB NA-1 、2、3a 、3 b 、3 c 和 LMP1。EB 病毒通過結(jié)合 B 淋巴細(xì)胞表面上的 EB 病 毒受體而感染 B 淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致 B 淋巴細(xì)胞的永生 化生長(zhǎng) 。通常情況下，只有 B 淋巴細(xì)胞能受到感 染，但在少數(shù)情況下，T 淋巴細(xì)胞也能受到感染， 并且可攻擊同一培養(yǎng)體系中已被 EB 病毒感染的 B 淋 巴細(xì)

47、胞，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的 B 淋巴細(xì)胞退化。環(huán)胞霉素 A 的主要作用是特異性地抑制了 T 淋巴細(xì)胞中的 RNA 聚合酶，導(dǎo)致 T 淋巴細(xì)胞失去對(duì) EB 病毒等感染的 免疫監(jiān)督作用，從而提高 B 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的成功率。 EB 病毒感染后大約 24 h，能觀察到兩個(gè)明顯的形態(tài) 學(xué)特征，即淋巴細(xì)胞明顯增大呈母細(xì)胞化和增殖的 淋巴母細(xì)胞凝聚成團(tuán) ，進(jìn)而繼續(xù)培養(yǎng)至 23 周無(wú) 退化，并能傳代培養(yǎng)及凍存復(fù)蘇后細(xì)胞能繼續(xù)良好 生長(zhǎng)，至此顯示成功地獲得 EB 病毒轉(zhuǎn)化的人永生 細(xì)胞系。 同時(shí), 細(xì)胞表面 LDLR 密度受環(huán)境中 LDL 濃度的 調(diào)節(jié), LDL 缺乏時(shí) LDLR 的密度上調(diào)。目前的 LPDS 誘導(dǎo)研究表明

48、, EB 病毒轉(zhuǎn)化的人淋巴母細(xì)胞表面的 LDLR結(jié)合LDL配體能力, 比未經(jīng)EB病毒轉(zhuǎn)化的淋巴 細(xì)胞高出 9 倍左右 21 20 19 125 致謝：承蒙中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué) 研究所李伯良研究員極其認(rèn)真地審閱此文，對(duì)本文 的寫作給予關(guān)鍵性的指導(dǎo)，并幫助做了大量的修 改，我們對(duì)他表示誠(chéng)摯的謝意。 參考文獻(xiàn) 1 Go lds t e in J L, B r ow n M S, H o bbs H H . Fam ili al hypercholesterolemia. In:Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D. edtors. The Me

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