通過響應面分析法優(yōu)化超聲提取澤瀉中多糖以及測定其抗氧化性

1、通過響應面分析法優(yōu)化超聲提取澤瀉中多糖以及測定其抗氧化性趙展翼a，張強b，李亞芳a，董路路a ,*，劉淑林a,c,*a哈爾濱醫(yī)藥大學藥劑學學院，哈爾濱150081，中國b哈爾濱醫(yī)藥大學圖書館，哈爾濱150081，中國c哈爾濱醫(yī)藥大學基因組學研究中心，哈爾濱150081，中國關鍵詞：澤瀉，多糖，超聲提取，響應面分析法，抗氧化性摘要：保持75.2分鐘，水料比為 30.1ml/g。在這樣的條件下，產(chǎn)量為6.9%，這遠遠高于傳統(tǒng)的熱水提取的產(chǎn)量（3.41%）。逐步乙醇沉淀的RAPs 表現(xiàn)出很強的抗氧化性。結(jié)果表明超聲提取是一種非常高效的提取RAP的方法，并且多糖可以作為一種用于醫(yī)藥以及功能保健食品的潛

2、在的抗氧化劑來研究。引言澤瀉(RA)是東方澤瀉(Sam)的根狀莖。Juzep屬于澤瀉科，主要分布于中國，日本和印度（Han et al.,2013；Wu ,2005）。在古代中國的第一部藥學著作神農(nóng)本草經(jīng)中，RA作為一種優(yōu)質(zhì)藥材被記載（Gu ,2007)。作為一種民間藥物，它用于治療高血壓，高血脂和糖尿病（China, 2005; Li & Qu, 2012; Wu, 2005），并且作為傳統(tǒng)中草藥之一包含在藥典之中（China ,2005)。最近，對RA的研究興趣日漸高漲。因為據(jù)報道，它的許多成分比如三萜烯，澤瀉醇B，特別是多糖具有重要的生物活性，包括抗HCV，抗炎，降血糖以及免疫效

3、應（Han et al., 2013; Jiang et al.,2006; Lee et al., 2013; Li & Qu, 2012; Shimizu, Ohtsu, Tomoda,Gonda, & Ohara, 1994; Tomoda, Gonda, Shimizu, & Ohara, 1994)。RAP因其對脂質(zhì)的抗氧化有抑制作用而被記錄，后者對人體健康具有潛在的重要性。然而，幾乎沒有關于有效提取RAP的研究。常見的方法比如通過熱水，浸入以及索氏提取法，往往既費時又昂貴，而且所獲得的RAP量極低，甚至會造成某些藥理學作用的喪失(Li, Ding, &

4、; Ding,2007; Wang, Cheng, Mao, Fan, & Wu, 2009)。超聲提取技術具有很多優(yōu)點，比如相當高的提取量，溫和的溶解環(huán)境，相對短的提取時間，等等，因此，已經(jīng)被用于從植物材料中提取優(yōu)質(zhì)生物活性的多糖(Hromadkova &Ebringerova, 2003; Hromadkova, Ebringerova, & Valachovic, 2002;Pan et al., 2010; Ying, Han, & Li, 2011 )。所以，超聲提取技術被用來提高RAP的提取量而產(chǎn)生對生物活性最小的影響。為了將這種技術應用于RAP，我

5、們用響應面分析法對提取環(huán)境和步驟進行了優(yōu)化，響應面分析法是當多種因素和反應可能對提取量產(chǎn)生影響時優(yōu)化反應過程的一個高效手段(Box & Wilson, 1951; PrakashMaran, Manikandan, Thirugnanasambandham, Vigna Nivetha, &Dinesh, 2013)。響應面分析法的主要優(yōu)勢在于相當程度得減少了評價多元變量和它們之間反應可能需要的試驗的次數(shù)，使得優(yōu)化過程比其他方法更加簡化。在此次研究中，基于單因子實驗的結(jié)果，三個主要的影響因子（超聲提取時間，水料比，超聲提取溫度）被用來優(yōu)化超聲提取RAP的實驗條件。根據(jù)不同分子量

6、的多糖在乙醇中有不同的溶解度，我們用逐步乙醇沉淀法獲得了兩種主要的多糖，它們都表現(xiàn)出強抗氧化性。1、 材料和方法2.1、材料 從黑龍江省采集的澤瀉，從西格瑪化工有限公司購買的DPPH，從西格瑪-奧德里奇購買的葡萄糖，超純水。2.2、RAP的提取和產(chǎn)量的確定 將干燥的RA用研磨機研磨成粉末(WND-200, Weinengda Instrument Co., Ltd., Zhejiang, China),然后根據(jù)我們之前的工作，在60下用85%乙醇抽提三次，每次五個小時，去除脂質(zhì)，色素，氨基酸，單糖和寡糖(Zhao, Xu, Ye, &Dong, 2013)。未溶解的部分通過過濾和干燥從

7、溶劑中分離出來(60 C, 24 h)。接著在一個特定的超聲提取時間，水料比和提取溫度下，通過超聲清除器利用經(jīng)過最小程度修改的Zhao et al. (2013) 和 Prakash Maran et al. (2013)的方法將多糖從預先處理的干燥粉末中抽提出來。 上清液通過真空過濾從未溶解的殘留物中分離出來，接著用謝瓦格法處理(Jia et al.,2014; Sevag, Lackman, & Smolens, 1938)三次以去除蛋白質(zhì) ，然后集中透析兩天去掉蒸餾水(cut-off Mw 3500 Da)。形成的溶液加入無水乙醇產(chǎn)生沉淀，最終濃度為80%，置于4下過夜。通過離心

8、赫爾凍干將沉淀物收集起來獲得RAP。用硫酸苯酚比色法以葡萄糖為標準測量糖含量(Balavigneswaran,Sujin Jeba Kumar,Moses Packiaraj,Veeraraj, & Prakash, 2013; Dubois, Gilles, Hamilton, Rebers, &Smith, 1951 )。RAP的百分含量可以通過下列公式計算出來：含量（%）= ×100 (1)WP指的是多糖的質(zhì)量，Wr 指的是原材料的質(zhì)量2.3、實驗設計2.3.1、單因子實驗、采用響應面優(yōu)化法優(yōu)化提取條 根據(jù)前期實驗的結(jié)果(Fig. S1)，接下來的實驗將選擇三個

9、主要的影響因子（超聲提取時間，水料比，超聲提取溫度）。上述三個因子對RAP超聲提取含量的影響通過單因子實驗來研究，詳細說，就是在一個特定的超聲提取時間（從30到90分鐘），水料比（從10到50ml/g ），以及超聲提取溫度（從50到80）下進行單因子實驗。在每個試驗中一個因子改變而其他因子保持不變。通過確定RAP的提取含量來衡量每個因子的效應。件 在單因子實驗結(jié)果的基礎上，確定了每個因子的范圍，一個具有三個變量（X1超聲提取時間；X2水料比；X3超聲提取溫度）三水平的響應面設計被用來評價RAP提取的最佳條件。對于數(shù)據(jù)計算，上述三個值按照下述等式計算： i=1,2,3 (2)是變量的編碼值，Xi

10、 是變量的實際值，X0是Xi 在中心點的實際值，X是變化值。表1是單獨變量的范圍和水平。表2是BBD的實驗序列。除了五個中心點外，每一個實驗的進行都是三個重復，最后取多糖含量的平均值作為最終值。 為了預測優(yōu)化條件，二次多項式適用于將獨立變量和結(jié)果（多糖含量）的關系聯(lián)系起來。 （3）表2 響應面優(yōu)化法實驗設計和澤瀉多糖提取量的結(jié)果操作編碼的變量水平含糖量（%）aX1X2X31-1-1021-103-11041105-10-1610-17-101810190-1-11001-1110-11120111300014000150001600017000a每個值都是三組測量值的平均值Y是預測值，Xi和X

11、j是自變量的編碼值，0、i、ii、ij分別是攔截、線性、二次和交互的回歸系數(shù)。每個實驗設計所得到的值都服從多元非線性回歸，這是用設計軟件專家繪制的響應面圖表。進行方差表的分析并確定了線性、二元、交互的效果以及回歸系數(shù)。模型的R2和調(diào)整后的R2值用來檢測模型的準確性。后來在優(yōu)化條件中進行額外的確定實驗用來證明統(tǒng)計實驗設計的有效性。認為當P值小于統(tǒng)計學意義。2.4 與傳統(tǒng)熱水提取的對比基于預實驗的結(jié)果，預處理的干燥粉末在水浴中回流提取兩次，提取時間120分鐘，水料比30ml/g，提取溫度75的步驟，可以獲得RAP并確定提取量。為了研究不同提取方式造成的結(jié)構(gòu)改變，F(xiàn)TIR分光光度計記錄了兩種方法（超

12、聲提取和熱水提?。┨崛颖镜母道锶~變換紅外光譜。干燥的樣品與溴化鉀粉末研磨，壓制成顆粒來進行頻率范圍從4000-400的 分辨率 最大源孔徑 的光譜測量。2.5 RAP的制備和分餾 通過上述的方法對澤瀉的經(jīng)過前處理的干燥粉末進行提取，再通過初步乙醇沉淀的方法進行分餾，分餾的步驟如下所示：將無水乙醇緩慢加入提取溶液中使乙醇濃度在40%。混合溶液在4下過夜，通過離心和凍干收集沉淀(RAP)。隨后將上清液加入乙醇使最終濃度為80%來沉淀(RAP)第二部分多糖。2.6 RAP的紅外光譜和分子量 天然RAP、RAP和RAP的特征吸收峰可以由FTIR光譜辨別。天然RAP的粉末和它的純化片段與溴化鉀相混合、

13、研磨并壓制進行FTIR檢測。步驟與的相同。RAP、RAP和RAP的分子量由粘度計來測定。2.7 抗氧化活性的確定2.7.1 DPPH自由基清除活性的測定 將前面所述的方法進行微小的修飾來測量DPPH自由基的清除活性。簡言之，準備甲醇保存的mM的DPPH溶液，取1ml該溶液加入3ml不同濃度mg/ml）的多糖水溶液。將混合物重復混勻，在25下于暗處孵育30min。然后在517nm處測量吸光值。反應混合物的吸光值越低表明自由基清除活性越高。清除百分比可以由以下公式進行計算：清除活性（%）=A0-(A1-A2)/A0*100 (4)A0是空白對照（水而不是樣本溶液）的吸光值，A1是樣本的吸光值，A2

14、是樣本在與A1相同的條件下以水代替DPPH溶液的吸光值。自由基清除活性的測定 根據(jù)之前描述的芬頓法，經(jīng)過最小限度的改進來測定羥基自由基的清除活性。將樣本溶解于蒸餾水中形成最終的濃度梯度（0.05、0.1、0.4、），并與mMFeSO4(1.0ml),0.3%H2O2(1.0ml)ml的水楊酸乙醇溶液共同孵育（37,30min）。每管混合物的總體積通過加入一定量的蒸餾水而達到10ml。以空白管作對照在510nm讀混合物的吸光值。羥基自由基的清除活性可以通過以下公式計算：清除活性（%）=(A0-A1)/A0*100 （5）A0 和A1代表空白對照組和實驗組在510nm的吸光值。 超氧陰離子自由基清

15、除活性的測定在弱堿性條件下，超氧陰離子自由基在鄰苯三酚自氧化過程中產(chǎn)生。對先前所述的方法進行微小改進來測量超氧陰離子自由基的清除效應。簡單來說，就是將不同濃度的樣本（0.05、0.1、0.4、）與50mMTris-HCl緩沖液在25下共同孵育20min，然后在相同溫度下加入25mM鄰苯三酚，使反應進行5分鐘，隨后快速加入1ml8mMHCl終止反應。在299nm測量其吸光值。超氧陰離子自由基的清除活性可以通過以下公式計算：清除活性（%）=（A0-A1）/A0*100 (6)A0是不加樣本的吸光值，A1是加樣本的吸光值。2.7.4 紅細胞溶血抑制活性的測定本實驗通過將實驗方法進行微小的修改來進行。

16、在實驗中，我們遵循美國國立醫(yī)學網(wǎng)站和哈爾濱醫(yī)科大學動物倫理委員會出版的實驗動物保健和使用指南這本書的指導。體重在150-200g之間的成年雄性大鼠來自隸屬于動物實驗管理委員會的哈爾濱醫(yī)科大學動物研究中心。環(huán)境溫度控制在22-24之間，50%的相對濕度和12小時的光暗周期，給所有大鼠都提供食物和水。簡言之，就是從健康大鼠體內(nèi)提取ml血液裝進含有肝素的離心管中，立即在2500轉(zhuǎn)下離心5min以獲得紅細胞。在4下將紅細胞在生理鹽水中清洗三次，再在生理鹽水中重懸以獲得2%的紅細胞懸浮物。將不同濃度的實驗樣本mg/ml）與紅細胞和雙氧水（7.5mM）在37和5%CO2存在下共同孵育三個小時，空白對照（生

17、理鹽水代替樣本溶液）以同樣的方式處理。孵育結(jié)束后，取出ml的孵育混合液ml的生理鹽水溶解，并在2500轉(zhuǎn)下離心5min。用熒光分光光度計在540nm處測量上清液的吸光值（A）。取相同體積的混合液加入ml冰冷的蒸餾水以獲得完整的溶血反應，并在相同的波長下讀取吸光值（B）。紅細胞溶血率可以通過(A/B)*100計算。2.8 統(tǒng)計學分析所有實驗都做了三個重復，顯示的數(shù)據(jù)是這些獨立實驗的平均值。使用設計專家軟件對響應面法進行統(tǒng)計學分析。對于多重比較可以使用方差分析的方法，當，認為具有統(tǒng)計學意義。3 結(jié)果和討論3.1 單因子實驗 在這部分，我們分別研究了超聲提取時間，水料比和提取溫度。單因子實驗的結(jié)果如

18、圖一所示。3.1.1 超聲提取時間對多糖產(chǎn)量的影響超聲提取時間是多糖提取的一個重要參數(shù)。在本實驗中，分別設置提取時間為30,45,60,75和90min來研究當其他參數(shù)相同時時間對多糖產(chǎn)量的影響，其他參數(shù)的設置如下：水料比為30ml/g，提取溫度為70。根據(jù)圖1a,多糖產(chǎn)量隨著提取時間的增加而提高。這個結(jié)果表明較長的超聲提取時間對RAP產(chǎn)量具有積極的影響。這可能是因為暴露RAP到能使液體穿透原材料的釋放介質(zhì)中，溶解RAP并最終使RAP從原材料中擴散出來的時間要求的原因。75min后，超聲提取時間越長，多糖產(chǎn)量的增加越緩慢，這意味著隨著提取時間的增加多糖產(chǎn)量將保持一個動態(tài)平衡。這可能是因為植物細

19、胞中的多糖已經(jīng)被充分提取了。3.1.2 水料比對多糖產(chǎn)量的影響 許多研究表明不同水料比將顯著影響多糖產(chǎn)量。在本實驗中，當其他參數(shù)相同時水料比分別設置為10,20,30,40和50ml/g，其他參數(shù)的設置如下：超聲提取時間為60min，提取溫度為70.如圖1b所示，多糖產(chǎn)量隨著水料比的增加而增加，當水料比為30ml/g時達到最大值。這是因為水料比越大植物細胞內(nèi)外溶劑的濃度差越大，并導致多糖大量運輸?shù)膭恿υ黾印５窃?0ml/g之后曲線趨于平緩，這意味著水料比再增加都不會提高多糖的提取量。這可能是較高的水料比延長了擴散到組織內(nèi)部的距離的原因，對產(chǎn)物收集造成了很大損失。3.1.3 超聲提取溫度對多糖

20、產(chǎn)量的影響如圖1c所示，研究了超聲提取溫度對多糖產(chǎn)量的影響。提取過程分別設置溫度為40,50,60,70和80，其他參數(shù)設置如下：提取時間為60min，水料比為30ml/g。圖1c表明當溫度從40增加到70時產(chǎn)量顯著提高，并達到頂峰（%）。超聲提取溫度的積極影響可以用多糖在溶劑中較高的溶解度，較高的擴散率以及高溫促進運輸來解釋。當溫度繼續(xù)上升時RAP產(chǎn)量開始減少。一種可能的解釋是高溫下多糖可能被水解。這個趨勢與其他之前的研究有很好的吻合。根據(jù)單因子實驗結(jié)果，我們調(diào)整RSM實驗超聲提取時間為60-90min，水料比為20-40ml/g，超聲提取溫度為60-80。3.2 通過BBD進行提取條件的優(yōu)

21、化 如表2 所示，完成了設計矩陣中的每個實驗并得到了實驗數(shù)據(jù)。利用設計專家軟件通過多元回歸分析對數(shù)據(jù)進行分析得到了下列多項式方程：Y1231X21X32X3122232 (7) F檢驗和p值被用來衡量表3所示的模型和結(jié)果的回歸系數(shù)的顯著性。如果絕對F值越大p值越小，則相關變量越顯著。二元回歸模型的方差分析表明該模型極顯著（p），結(jié)果顯示該模型適用于預測范圍之內(nèi)使用的變量。同時可以看到對RAP產(chǎn)量具有顯著效應的變量是線性的（X3），二次的(X1*X1，X2*X2,X3*X3)以及X1和X3的交互。如表3所示，決定系數(shù)（R2）和變異系數(shù)分別是6%，這表明多項式模型方程具有高的配合等級，好的精度和可

22、靠性。通過設計專家軟件繪制響應面來解釋變量之間的相互作用并確定每個變量獲得最大響應頻率的最優(yōu)水平。如圖2和圖3所示是三維響應面和二維等高線。每個數(shù)字都表示當另一個因子處在零水平時其他兩個因子對多糖產(chǎn)量的效應。圖2a和圖3a的3-D圖和等高線圖設置超聲溫度為零水平，圖顯示在最初階段隨著超聲提取時間和水料比的增加多糖產(chǎn)量液隨之提高，隨后緩慢降低。圖2b和3b是在不同的提取時間和提取溫度下的3-D圖和等高線圖。從這些數(shù)字可以看出多糖產(chǎn)量隨著提取溫度和提取時間的增加而提高，但是當提取溫度繼續(xù)增加時多糖產(chǎn)量不會隨之提高。結(jié)果與單因子實驗和方差分析一致。當提取時間處于零水平時，自變量水料比和提取溫度為基礎

23、的3-D圖和等高線圖如圖2c和3c所示。水料比和提取溫度的引起的多糖產(chǎn)量的變化趨勢與上面提及的相似。用設計專家軟件進行響應面分析來確定最優(yōu)提取條件。最優(yōu)提取條件分別是超聲提取時間為in，水料比為30.1ml/g，超聲提取溫度為，RAP的最大預測產(chǎn)量是%。3.3 模型檢驗 使用挑選的最優(yōu)條件來檢驗預測最優(yōu)響應值的模型方程的適用性。在優(yōu)條件下，實際實驗的得到的均值為%，證明了提取模型的驗證。這些結(jié)果之間好的相關性印證了該模型足夠反映期望的最優(yōu)化條件。3.4 與傳統(tǒng)熱水提取的對比與傳統(tǒng)熱水提取相比較，超聲提取的應用積極地影響了RAP的產(chǎn)量（表4）。與熱水提取相比提取時間極大地縮短。這是因為超聲波輻射

24、可以促進提取進程，可能促進生物活性物質(zhì)的提取。超聲提取應該是一項合適且高效的從澤瀉中提取多糖的技術，這一點是確定的。為了證明超聲提取和熱水提取對多糖官能團的影響，記錄了兩種方法提取的紅外光譜。如圖4a和d所示，在3435cm處有一個寬且強烈的由兩種不同方法提取的多糖吸收峰，這歸因于羥基。在2900-3000處出現(xiàn)了一個微弱的-CH拉伸峰。1600-1700處的強烈吸收峰歸因于羰基。1400處的峰是羧基出現(xiàn)的跡象。根據(jù)紅外光譜分析，由兩種方法提取的多糖官能團基本是相同的。3.5 RAP的紅外光譜和分子量 圖4a-c可以看到，RAP,RAP和RAP的紅外光譜基本上是沒有區(qū)別的，僅僅在帶的亮度上有一

25、些差異。在3600-3200,3000-2800，1250-1000范圍內(nèi)的吸收帶是多糖的特征吸收峰，這同樣可以在葡聚糖的紅外光譜中看到。這些結(jié)果說明RAP與葡聚糖具有相同的主要結(jié)構(gòu)和相似的典型官能團。在3435左右的強烈吸收峰屬于羥基的伸縮振動。2980和1390左右的微弱峰是C-H鍵不對稱振動造成的。1630處的帶是C=O雙鍵不對稱伸縮振動吸收峰。在1000-1200區(qū)域有一個強烈的廣泛吸收峰，是因為在光譜中觀察到了C-O-C和C-OH側(cè)鏈基團。另外，850的特征帶是由于型糖苷鍵的原因。RAP,RAP和RAP的分子量分別是kDa， kDa，103.13 kDa。3.6 RAP的抗氧化活性3

26、.6.1 DPPH自由基的清除活性DPPH自由基是一種比較穩(wěn)定的自由基，在抗氧化劑存在時接受電子或氫而被清除，被廣泛用來評價抗氧化劑的自由基清除活性。圖5a描述了不同濃度的多糖樣本的DPPH清除能力。所有樣本的DPPH清除活性均表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。但是當樣本濃度高于mg/ml時，清除能力沒有明顯的增加。RAP比其他樣本表現(xiàn)出了更強的DPPH清除能力，RAP和RAP的DPPH清除能力沒有明顯的差別。許多因素影響抗氧化劑對DPPH的清除效應，一些文章報道單糖單元的羥基能貢獻質(zhì)子來結(jié)合DPPH的未配對電子，以形成非基DPPH-H。3.6.2 羥基自由基的清除活性羥自由基是危害最大的活性氧之一，它

27、能夠輕易地穿過細胞膜與包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及指導細胞凋亡的DNA在內(nèi)的生物分子發(fā)生反應。因此清除羥自由基對于保護生命系統(tǒng)非常重要。羥自由基的清楚活性如圖5b所示。在相對低的濃度條件下（<0.2mg/ml）清除效應隨著樣本濃度的增大而增高。這個結(jié)果證明所有RAP樣本都具有潛在的清除羥自由基的抗氧化能力。當清除能力達到平臺期，RAP的清除能力最低，RAP和RAP的清除能力相似。抗氧化劑對羥自由基的清除效應可能是由于存在于多糖中的羥基，它能夠貢獻出氫原子來結(jié)合羥自由基以達到清除效果。3.6.3 超氧化物陰離子自由基的清除活性超氧化物陰離子自由基是一種弱氧化劑，但是它能夠持續(xù)降解而形成其他活躍的活性氧，然后誘導病理反應。因此，清除超氧化物陰離子自由基