免疫熒光雙標(biāo)操作方法及注意事項(xiàng)

1、在同一組織細(xì)胞標(biāo)本上需要同時(shí)檢測兩種抗原時(shí)，需進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧ｋp重免疫熒光標(biāo)記法(double immuno fluoresce nee labeli ng method) 也分為直接法和間接法。(1) 直接法雙重免疫熒光標(biāo)記：將標(biāo)記有兩種不同熒光素的抗體(如抗A和抗B)以適當(dāng)比例混合，滴加在標(biāo)本上孵育，然后洗去未結(jié)合的熒光抗 體，在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應(yīng)的激發(fā)濾片觀察，即可對兩種抗 原進(jìn)行定位和定量。直接法簡便可靠，但靈敏度較低。(2) 間接法雙重免疫熒光標(biāo)記：用未標(biāo)記的兩種特異性第一抗體孵育組織或細(xì)胞，洗去多余的第一抗體后，再用兩種不同的熒光素分別標(biāo)記的 第二抗體孵育組織或細(xì)胞，洗

2、去多余的第二抗體，后在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應(yīng)的激發(fā)濾片觀察，從而對兩種抗原進(jìn)行定位和定量。使 用此法應(yīng)注意兩種特異性第一抗體必須來源于不同種屬，且熒光標(biāo)記第二抗體的種屬必須與第一抗體的種屬相匹配。免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)中操作要點(diǎn)和注意事項(xiàng)一、免疫熒光技術(shù)中標(biāo)本制作的基本程序近似于酶免疫組化，不同點(diǎn)如下：1、免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其相同。2、免疫熒光的二抗使用不同熒光標(biāo)記的二抗孵育，孵育時(shí)間根據(jù)抗 體的工作濃度確定。3、二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。4、 免疫熒光在封片時(shí)常使用專用封片劑或甘油：0.01M PBS (1:1)。 條件許可，建議購買抗淬滅的封片

3、液，使標(biāo)本可以保存更久。5、熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要避光。6、熒光抗體染色假陽性可能會(huì)多，需要分別設(shè)定陽性和陰性對照。二、注意事項(xiàng)1、 熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4C保存4h,時(shí)間過長， 可能會(huì)使熒光提前衰退。2、每次試驗(yàn)均需設(shè)置以下三種對照：(1) 陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物；(2) 陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物；(3) 熒光標(biāo)記物對照：PBS熒光標(biāo)記物。三、免疫熒光雙標(biāo)的經(jīng)驗(yàn)之談1、選取一抗時(shí)，要求來源于兩種不同的動(dòng)物，我用的是來源于家兔和大鼠的抗體，二抗則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC( 綠)和 donkey anti-

4、rat-Tex-Red(紅)。2、我的做法是兩種一抗同時(shí)孵育，然后兩種二抗同時(shí)孵育?？贵w濃度、 孵育時(shí)間要自我摸索，我感覺一抗4C孵育過夜比較好，背景比較清晰。3、 我的陽性對照采用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大 鼠的IgG，熒光標(biāo)記物對照是 PBS熒光標(biāo)記物。4、 封閉血清是二抗來源動(dòng)物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。5、其余事項(xiàng)同免疫熒光單標(biāo)操作。免疫組化雙重染色方法和步驟在生物醫(yī)學(xué)和臨床研究實(shí)踐中，經(jīng)常需要檢測兩種不同物質(zhì)是否在同一樣品中共存或同一種細(xì)胞中共存，因此出現(xiàn)了免疫組織化學(xué)雙重染色。 此方法有幾種類型，包括免疫酶組織化學(xué)和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法結(jié)合；同

5、一切片的再度染色法（先對第一種抗原染色，陽性部位拍照，再用酸 處理使抗原抗體解離，繼之，對第二種抗原染色、拍照）;兩種酶標(biāo)抗體3又重染色（分別用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶標(biāo)記第二抗體.用間接法分別顯示A和B抗原，如兩種一抗來自同一種屬，常有重疊染色 ）；不 同種屬來源的抗體雙重染色。目前，最常用的是最后一種方法。不同種屬來源的抗體雙重染色，兩種抗體間無交又反應(yīng)特異性較高，即使細(xì)胞內(nèi)抗原量很少也能檢測。 但是，當(dāng)兩種抗原存在于同一部位而 其中之一濃度較高，占絕對優(yōu)勢時(shí)將妨礙另一種抗原染色，此種情況應(yīng)分別染色，首先染色含量較少的抗原，再顯示含量豐富的抗原。在該方 法中應(yīng)用最多的是把SABC法或SP

6、法的實(shí)驗(yàn)流程重復(fù)兩次，其中兩種不 同特異性抗體（可以是小鼠或大鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體的任何兩 個(gè)組合），與一抗對應(yīng)的不同種屬生物素化二抗和兩種不同顯色系統(tǒng)。即可將不同部位或相同部位的兩種抗原顯示出來。該方法用于石蠟切片時(shí)應(yīng)考慮所選擇的兩個(gè)抗體的修復(fù)方法應(yīng)該一致或一個(gè)抗體的修復(fù)對 另一個(gè)抗體的染色結(jié)果沒有影響。SP法雙重染色步驟16步驟與SABC法相同，但無需使用生物素阻斷劑：7. 切片加入A特異性抗體（如兔抗A抗體），4=C過夜孵育后，PBS沖洗3 次，每次5分鐘8. 滴加生物素化二抗（如抗兔二抗），室溫孵育切片10分鐘，繼而PBS 沖洗3次，每次5分鐘；9. 滴加鏈霉菌抗生物素蛋白 一堿

7、性磷酸酶，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗 3次，每次5分鐘10. 堿性磷酸酶顯色液（BCIP/NBT）顯色（紫藍(lán)色）.PBS沖洗3次，每次5 分鐘；11. 滴加0.05%鹽酸，室溫10分鐘（可避免已顯色的抗原褪色）；12. 滴加抗小鼠二抗同種屬的非免疫血清，37C孵育10分鐘；13. 滴加B特異性抗體（如小鼠抗B抗體），4C過夜孵育。PBS沖洗3次， 每次5分鐘；14. 滴加生物素化抗小鼠二抗，室溫孵育切片10分鐘。PBS沖洗3次，每次5分鐘：15. 滴加鏈霉菌抗生物素蛋白 一過氧化物酶，室溫孵育10分鐘，PBS沖 洗3次，每次5分鐘16. 過氧化物酶顯色液（AEC）顯色（鮮紅色）.PBS沖洗3次，每次5分鐘17. 蘇木精復(fù)染細(xì)胞核；18. 水溶性封片劑封片。在使用SP法雙重染色之前需要對待測抗原的性質(zhì)、二抗的種屬類 型和顯色系統(tǒng)進(jìn)行詳細(xì)設(shè)計(jì)。購買免疫組化雙染試劑盒時(shí)；應(yīng)選擇與設(shè)計(jì)方案相同的配套試劑。在選擇一抗時(shí)應(yīng)避免定位在細(xì)胞的同一部位 （如胞核、胞漿和胞膜）的兩種抗原，如果不可避免，最好選擇免疫熒光 組織細(xì)胞化學(xué)雙重染色方法，因?yàn)閮煞N不同顏色的熒光重疊后呈現(xiàn)另一 種顏色的熒光（如紅色熒光與綠色熒光重疊呈現(xiàn)黃色熒光），它比SP法 的顯色系統(tǒng)更容易區(qū)別和辨認(rèn)陽性結(jié)果。在進(jìn)行