LMO3 mRNA在小鼠腦發(fā)育過程中的表達(dá)

1、LMO3 mRNA在小鼠腦發(fā)育過程中的表達(dá)                   作者：惠玲，蔡文琴，紀(jì)華，呂同德，楊金升，趙治華   【關(guān)鍵詞】  LMO3；原位雜交組織化學(xué)；小鼠；腦【Abstract】 AIM: To examine the localization of neuronal specific transcription factor LMO3 mRNA in the

2、development of central nervous system (CNS) of the mice. METHODS: Realtime fluorescence quantitative RTPCR(FQ RTPCR) and in situ hybridization histochemical staining method with digoxinlabeled cRNA probe were used to detect the expression of  LMO3 mRNA. RESULTS: The FQ RTPCR showed that the exp

3、ression of LMO3 mRNA was the highest during pregnancy, then it decreased significantly after birth and almost remained the same level until adult. LMO3 mRNA expression was extensive in brain at early embryonic stages (E10.511.5 d), but not detected at other parts of embryo. The high level in brain w

4、as still seen over mid(E15.5d) and late (E17.5P0 d) embryonic brain and showed less different signal. During postnatal development, LMO3 mRNA was found gradually regionalized and showed the difference of signal in different parts of brain. LMO3 mRNA expression of P14P60 d was still extensive althoug

5、h the extent was gradually  more regional than that of  P7d. The signal of  LMO3 mRNA was mainly located in different nucleus clony and showed different intensity. CONCLUSION: LMO3 plays a role in brain development during embryonic period and postnatal differentiation and specificatio

6、n of specific brain regions.【Keywords】 LMO3; in situ hybridization histochemistry; mice; brain【摘要】 目的： 研究不同發(fā)育時(shí)期小鼠腦內(nèi)LMO3的表達(dá). 方法： 采用以SYBR Green I為熒光染料的定量RTPCR及以地高辛標(biāo)記的cRNA為探針的原位雜交組織化學(xué)法檢測LMO3基因在小鼠腦發(fā)育過程中的表達(dá). 結(jié)果： FQ RTPCR結(jié)果表明，LMO3在出生前高表達(dá)，P7d后表達(dá)水平急劇下降，至成年都維持在一個(gè)較低的水平. LMO3 mRNA在小鼠胚胎期E10.5d即有表達(dá)，但僅限于整個(gè)腦泡組織內(nèi)，胚

7、體其他區(qū)域均為陰性；E11.5d腦區(qū)信號(hào)逐漸加強(qiáng)，無核團(tuán)及腦區(qū)的特異性，胚體其他部分仍為陰性；E15.5P0d期LMO3陽性信號(hào)在幾乎所有觀察的腦區(qū)均有廣泛而較強(qiáng)的著色；P7d LMO3陽性信號(hào)較出生前變?nèi)酰植贾饾u集中；P14P60d LMO3 mRNA表達(dá)范圍較P7d逐漸縮小，但仍有廣泛表達(dá)，陽性信號(hào)主要集中于不同核團(tuán)，表達(dá)有強(qiáng)弱之分. 結(jié)論： LMO3基因可能與小鼠出生前腦的發(fā)育以及出生后特定腦區(qū)神經(jīng)元的特化及特性維持有關(guān). 【關(guān)鍵詞】 LMO3；原位雜交組織化學(xué)；小鼠；腦0引言多巴胺相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子DAT1 (GenBank登錄號(hào)： AF258348)又稱LMO3，是我們獲得的星

8、形膠質(zhì)細(xì)胞在DA作用下發(fā)生反應(yīng)性變化時(shí)上調(diào)表達(dá)的基因之一1. LMO家族由4個(gè)成員組成，即LMO1LMO4. 我們以往的研究證實(shí)LMO3 mRNA在成年大鼠和小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中分布廣泛，提示LMO3基因在CNS有重要作用2.  本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR方法及原位雜交組織化學(xué)的方法對(duì)LMO3 mRNA在小鼠腦發(fā)育過程中的表達(dá)變化進(jìn)行了研究，以探討LMO3在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用.1材料和方法1.2.1熒光定量RTPCR采用Tri 201試劑提取制備總RNA，測定A260 nm對(duì)RNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量. 取2 g總RNA，經(jīng)MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈，以此為模板

9、進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，熒光介質(zhì)選用SYBR Green I，根據(jù)同時(shí)擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各樣本的初始拷貝數(shù)，結(jié)果以LMO3 copies/G3PDH copies表示LMO3 mRNA在各組起始RNA中的相對(duì)含量. 在PCR后進(jìn)行融解曲線分析以確定得到的產(chǎn)物是否為目的產(chǎn)物，溫度以0.2/s的速率從55緩慢遞增到100. 同時(shí)將反應(yīng)產(chǎn)物置20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性. 1.2.2原位雜交組織化學(xué)全胚胎原位雜交  新鮮取材的鼠胚(E10.511.5)用PBS洗2次，入4%多聚甲醛固定過夜，PBT洗2次后，用250 mL/L甲醇PBT, 500 mL/

10、L甲醇PBT, 750 mL/L甲醇PBT, 純甲醇PBT梯度脫水，(可-20儲(chǔ)存?zhèn)溆?，用時(shí)再用甲醇PBT水化)，用含60 mL/L H2O2的PBT漂洗1 h, 10 g/mL的蛋白酶K消化，2 mg/mL甘氨酸洗2次，2 g/L戊二醛后固定20 min,雜交液中70預(yù)雜交2 h，含1 g/mL LMO3探針的雜交液中過夜,溶液洗2次，每次30 min,溶液洗2次，每次10 min, 100 g/mL RNaseA洗2次，每次30 min；TBST洗3次，100 mL/L羊血清室溫封閉1 h，抗地高辛抗體11000孵育過夜，TBST洗5次，新鮮配制的AKP Buffer(pH 8.0)洗3次

11、，NBT/BCIP暗處顯色，PBT洗3次，中止顯色，40 g/L多聚甲醛固定過夜，PBT漂洗，甘油透明，4保存. 同時(shí)設(shè)陽性及陰性對(duì)照(同切片原位雜交). 切片原位雜交：0.1 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗5 min×3次，3 g/L TritonX100/PBS(RNase free)漂洗25 min，蛋白酶K(2 g/mL)于37孵育30 min，(于0.1 mol/L TrisHCL pH 8.0; 50 mmol/L EDTA緩沖液中)，40 g/L多聚甲醛中漂洗5 min×2次，0.1 mol/L PBS(RNase free)漂洗5 min&

12、#215;2次，浸入新配制的0.1 mol/L TrisHCL (pH 8.0，含25 g/L乙酸酐)5 min, 2×SSC漂洗10 min，切片在含0.5 g/mL地高辛標(biāo)記的LMO3 cRNA探針的雜交液中42反應(yīng)24 h后，20×SSC中漂洗15 min，轉(zhuǎn)入4×SSC中漂洗5 min，2×SSC中(含RNaseA 20 g/mL)漂洗30 min(37)，1×SSC，0.5×SSC中各漂洗10 min(37)，0.05 mol/L PBS漂洗10 min×2次，將切片移入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體中孵育4 h(37)，