DP307--酵母基因組提取試劑 - 圖文-

1、產(chǎn)品簡(jiǎn)介本試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng),用于提取酵母細(xì)胞中的基因組DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料為本公司特有新型材料,高效、專(zhuān)一吸附DNA,可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。提取的基因組DNA片段大,純度高,質(zhì)量穩(wěn)定可靠。使用本試劑盒回收的DNA可適用于各種常規(guī)操作,包括酶切、PCR、文庫(kù)構(gòu)建、Southern雜交等實(shí)驗(yàn)。菌體濃度檢測(cè)可采用分光光度計(jì)或平板培養(yǎng)法檢測(cè)菌體量,一般對(duì)于釀酒酵母,OD600值為1.0時(shí),相當(dāng)于12×107 cells / ml。注意事項(xiàng)<請(qǐng)務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項(xiàng)>1.樣品應(yīng)避免反復(fù)

2、凍融,否則會(huì)導(dǎo)致提取的DNA片段較小且提取量也下降。2.若緩沖液GA或GB中有沉淀,可在56水浴中重新溶解,并搖勻后使用。3.所有的離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下進(jìn)行。需要自備的試劑1、Lyticase (目錄號(hào):RT4102、山梨醇buffer:用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.4配制1.2 M山梨醇;0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.4的配制:操作步驟:使用前請(qǐng)先在使用前請(qǐng)先在緩沖緩沖緩沖液液GD和漂洗液PW中加入無(wú)水乙醇中加入無(wú)水乙醇,加入體積請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽標(biāo)簽。1. 取酵母細(xì)胞(最多不超過(guò)5×107cells,12,000 rpm(13,400×g 離心1分鐘,盡量

3、吸除上清(菌液較多時(shí)可以通過(guò)幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中。2. 酵母細(xì)胞壁的破除:酶法:向菌體中加入600 µl山梨醇buffer,加入大約50 U Lyticase(客戶(hù)自備,目錄號(hào):RT410,充分混勻。30處理30分鐘。4000rpm(1500×g離心10鐘,棄上清,收集沉淀。注意注意:以上為5×107酵母細(xì)胞的Lyticase用量用量,根據(jù)酵母的菌株和根據(jù)酵母的菌株和酵母酵母酵母細(xì)細(xì)胞數(shù)量數(shù)量的不同的不同的不同,所用Lyticase的濃度和孵育時(shí)間應(yīng)該進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整的濃度和孵育時(shí)間應(yīng)該進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。3. 向沉淀中加入200 µl緩沖液GA重

4、懸沉淀,充分混勻。4. 加入20 µl蛋白酶K溶液,混勻。注意注意:如果需要去除RNA,可加入4 µl RNaseA(100 mg/ml溶液(客戶(hù)自備客戶(hù)自備,目錄號(hào):RT405-11,顛倒混勻顛倒混勻,室溫放置5分鐘分鐘。5. 加入220 µl緩沖液GB,充分顛倒混勻,70放置10分鐘,溶液應(yīng)變清亮,簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。注意注意:加入緩沖液GB時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀,一般70放置時(shí)會(huì)消失放置時(shí)會(huì)消失,不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如溶液未變清亮如溶液未變清亮,說(shuō)明細(xì)胞裂解不徹底說(shuō)明細(xì)胞裂解不徹底,可能導(dǎo)致提取DNA量少和提取的DNA

5、不純不純。6. 加220 µl 無(wú)水乙醇,充分顛倒混勻,此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀,簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。7. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中,12,000 rpm(13,400×g 離心30秒,倒掉廢液,將吸附柱CB3放入收集管中。8. 向吸附柱CB3中加入500 µl緩沖液GD(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇,12,000 rpm(13,400×g 離心30秒,倒掉廢液,將吸附柱CB3放入收集管中。 9. 向吸附柱CB3中加入700 µl 漂洗液PW(使用前請(qǐng)先檢查

6、是否已加入無(wú)水使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇乙醇,12,000 rpm(13,400×g 離心30秒,倒掉廢液,將吸附柱CB3放入收集管中。10. 向吸附柱CB3中加入500 µl 漂洗液PW ,12,000 rpm(13,400×g 離心30秒,倒掉廢液。11. 將吸附柱CB3放回收集管中,12,000 rpm(13,400×g離心2分鐘,倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。注意注意:這一步的這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,漂洗液中乙醇

7、的殘漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切酶切、PCR 等實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。12. 將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 µl 洗脫緩沖液TE ,室溫放置2-5分鐘,12,000 rpm(13,400×g 離心2分鐘,將溶液收集到離心管中。注意注意:為增加基增加基因組因組DNA 的得率,可將離心得到的溶液再加入吸附柱中可將離心得到的溶液再加入吸附柱中,室溫放置2分鐘分鐘,12,000 rpm (13,400×g 離心2分鐘分鐘。 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 µl ,體積過(guò)小影響回收效率體積過(guò)小影響回

8、收效率。洗脫液的pH 值對(duì)于洗脫效率有很大影響值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH 值在7.0-8.5范圍內(nèi)(可以用NaOH 將水的pH 值調(diào)到此范圍,pH 值低于7.0會(huì)降低洗脫效率會(huì)降低洗脫效率;且DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在-20,以防DNA 降解降解。DNA 濃度及純度檢測(cè)得到的基因組DNA 片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)?；厥盏玫降腄NA 片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。DNA 應(yīng)在OD 260處有顯著吸收峰, OD 260值為1相當(dāng)于大約50 µg/ml 雙鏈DNA 、40 µg/ml 單鏈DNA 。OD 2

9、60/OD 280比值應(yīng)為1.71.9,如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液,而使用去離子水,比值會(huì)偏低,因?yàn)閜H 值和離子存在會(huì)影響光吸收值,但并不表示純度低。TIANamp Yeast DNA Kit 酵母基因組DNA 提取試劑盒(離心柱型離心柱型目錄號(hào)目錄號(hào):DP307試劑盒內(nèi)容試劑盒內(nèi)容:試劑盒組成 DP307-02 (50次 緩沖液GA 15 ml 緩沖液GB 15 ml 緩沖液GD 13 ml 漂洗液PW 15 ml 洗脫緩沖液TE 15 ml 蛋白酶K 1ml 吸附柱CB3 50個(gè) 收集管(2 ml 50個(gè) 說(shuō)明書(shū)1份選配試劑選配試劑:RNaseA (100 mg/ml (目錄號(hào):RT405-11。儲(chǔ)存條件儲(chǔ)存條件:該試劑盒置于室溫(1525干燥條件下可保存12個(gè)月;更長(zhǎng)時(shí)間的保