從噬菌體表面展示環(huán)狀7肽肽庫中篩選葡萄球菌B型腸毒素抑制劑(1)

1、    從噬菌體表面展示環(huán)狀7肽肽庫中篩選葡萄球菌B型腸毒素抑制劑(1)    】 目的： 擬通過生物淘選從噬菌體表面展示環(huán)狀7肽肽庫中篩選出與葡萄球菌B型腸毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)結(jié)合并能抑制該毒素毒性效應(yīng)的特異性短肽. 方法： 采用PhageELISA來鑒定所得目的肽的親和性；利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA研究合成肽與SEB mAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合SEB的情況；通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考察其抑制SEB的超抗原特性和腸毒活性情況. 結(jié)果： 篩選所得短肽在一定濃度范圍內(nèi)可以抑制SEB對(duì)鼠脾淋巴細(xì)胞

2、的激活；合成肽與SEB質(zhì)量比1601下，合成肽可較好地抑制SEB對(duì)乳貓的腸毒活性，并對(duì)SEB引起的小鼠致死具有明顯保護(hù)作用. 結(jié)論： 得到了能與SEB特異結(jié)合并能抑制SEB超抗原特性和腸毒活性的短肽.【關(guān)鍵詞】 葡萄球菌B型腸毒素；肽庫;篩選;抑制劑0引言葡萄球菌B型腸毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)1是超抗原(SAg)家族的主成員之一，該毒素可以造成食物中毒，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致致死性休克. SEB中毒后缺乏特異的治療手段，因此研究SEB的特異高效抑制劑具有重大的意義. 我們利用固相篩選方法，即以SEB作為親和靶標(biāo)蛋白，從環(huán)狀7mer肽噬菌體文庫中篩選到與

3、SEB結(jié)合，并能抑制該毒素毒性效應(yīng)的噬菌體克隆. 結(jié)果表明，所篩選環(huán)狀7mer肽在細(xì)胞水平上可抑制SEB對(duì)小鼠脾細(xì)胞的激活，在整體動(dòng)物水平上對(duì)SEB導(dǎo)致的毒性具有一定保護(hù)作用.1材料和方法隨機(jī)肽庫的擴(kuò)增、定量按照所附試劑盒說明書進(jìn)行；純化按QIAprepM13 Handbook進(jìn)行. 親和靶標(biāo)蛋白SEB的分離純化與定量按文獻(xiàn)2方法進(jìn)行. 依據(jù)優(yōu)勢(shì)噬菌體陽性克隆序列合成相應(yīng)的多肽,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院六所合成, 并進(jìn)行了多肽純化和脫鹽處理,合成多肽的純度達(dá)95%以上. 將純化的SEB與0.1 mol/L NaHCO3(pH 8.6)相混合, 制成質(zhì)量濃度為1 g/ L的溶液,取100 L混合液加于酶

4、聯(lián)條微孔進(jìn)行包板固定，于4過夜；次日棄包被液后，加200 L濃度為 50 g/L BSA于酶聯(lián)孔中進(jìn)行封閉，37結(jié)合2 h,間隙振蕩；棄封閉液，取100 mL/L TBST液200 L洗滌6次,間隔為5 min/次,然后將10 L肽庫原液加于含有100 L TBST的酶聯(lián)孔中,室溫輕搖過夜;次日棄未結(jié)合的噬菌體,取100 ml/L TBST 200L洗滌10次,間隔為3 min/次,最后加80 L洗脫緩沖液,室溫輕柔吹打10 min后,將洗脫得到的噬菌體轉(zhuǎn)入微量離心管中,立即加入15 L 1 mol/L TrisHCL(pH 9.1)進(jìn)行中和. 將所得噬菌體進(jìn)行感染、擴(kuò)增、純化后進(jìn)行下一輪篩選

5、. 在后續(xù)的篩選中TBST的濃度增為500 mL/L. 隨機(jī)挑取第3輪噬菌體單克隆進(jìn)行培養(yǎng)后進(jìn)行PhageELISA分析及DNA序列測(cè)定. 將SEB包被酶聯(lián)板，經(jīng)30 g/L BSA封閉后加入培養(yǎng)好的單克隆上清，采用PhageELISA法檢測(cè)SEB與噬菌體的結(jié)合情況. ssDNA的提取按照QIAprepM13 Handbook進(jìn)行，純化好的ssDNA送往上海博大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定.1.2.1活性測(cè)定 采用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA考察多肽與SEB的結(jié)合情況, SEB包被量為25 g. 取100 g/L mAb 100 L,分別與噬菌體單克隆上清200, 100, 50, 25, 0 L，其中不足20

6、0 L的以8.5 g/L NaCl補(bǔ)齊，然后加兔抗鼠抗體標(biāo)記的HRP顯色，A450 nm比色，觀察競(jìng)爭(zhēng)效果. 結(jié)果判斷的依據(jù)為A值下降，說明多肽抑制了mAb的結(jié)合. 以鼠脾淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞，采用噻唑藍(lán)（MTT）法評(píng)價(jià)合成肽對(duì)SEB超抗原的體外抑制活性.1.2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 幼貓腹腔接種保護(hù)實(shí)驗(yàn)： 所用幼貓?bào)w質(zhì)量約為450 g. 將純化SEB 5 g溶解于5 mL生理鹽水，制成實(shí)驗(yàn)對(duì)照用液；合成肽與SEB按1601質(zhì)量比進(jìn)行混合用藥. 實(shí)驗(yàn)用量為每只4 mL，在5 h內(nèi)發(fā)生嘔吐、腹瀉者為陽性. 單純使用SEB的組稱為對(duì)照組，使用合成肽與SEB的組稱為實(shí)驗(yàn)組. 合成肽對(duì)小鼠的保護(hù)實(shí)驗(yàn)3： 實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)

7、物為體質(zhì)量1822 g的雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為單純使用SEB組、使用致敏劑D半乳糖（DGal）組、使用SEB DGal synthetic 7mer peptide組與使用SEB DGal組. 合成肽與SEB的比例按照1601進(jìn)行混合用藥，SEB用量5 g/鼠. 致敏劑D半乳糖（DGal）母液濃度為20 mg/鼠.     統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，利用單樣本t檢驗(yàn)對(duì)單克隆原種親和性進(jìn)行分析, 合成肽對(duì)小鼠的保護(hù)抑制利用成組設(shè)計(jì)多樣本比較的秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.  

8、;  2結(jié)果            作者：李韓平，周宏，鄭玉玲，鄧小紅，馬茹，姜永強(qiáng)【關(guān)鍵詞】葡萄球菌B型腸毒素Screening inhibitor of Staphyloco         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們

9、。將本室重組表達(dá)的蛋白進(jìn)行CMFF離子交換層析. 純化產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE分析，可獲得高純度的SEB(Fig 1), 為證明噬菌體肽庫淘選的有效性，即有富集現(xiàn)象出現(xiàn)，需計(jì)算每輪淘選產(chǎn)量，每次加入噬菌體數(shù)固定. 通過3輪淘選發(fā)現(xiàn)，隨著淘選次數(shù)的增加，出現(xiàn)了富集，噬菌體環(huán)狀7肽肽庫第3輪比第一輪的產(chǎn)量高出1.375倍. 經(jīng)過3輪親和篩選，隨機(jī)挑選14個(gè)分隔良好的單克隆制備原種，進(jìn)行PhageELISA鑒定，以高出陰性對(duì)照5倍的單克隆作為陽性克隆,結(jié)果如Fig 2，其中15為陰性對(duì)照. 對(duì)噬菌體單克隆原種A450進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn)，t0.05/2（13）=2.160t=10.85, P0.05，相對(duì)

10、于陰性對(duì)照A450，噬菌體單克隆原種A450具有顯著性差異. 從以上結(jié)果可以看出，經(jīng)過3輪篩選噬菌體得到了明顯富集，可見親和篩選的方法是有效的，已得到與SEB特異結(jié)合的短肽. 選取10個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序 ，推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列. 即為噬菌體外源蛋白與噬菌體外殼蛋白融合展示的環(huán)狀7肽. 通過篩選得到的陽性克隆序列具有很好的一致性，均為CLPRQSSFC. 2結(jié)果        2.1合成肽對(duì)SEB超抗原作用的體外抑制活性合成多肽的純度達(dá)實(shí)驗(yàn)求，質(zhì)譜分析測(cè)定的分子量與理論值相符，說明合成的多肽結(jié)構(gòu)正確，合乎測(cè)試求，可

11、用于生物學(xué)活性的檢測(cè)和評(píng)定. 將與SEB高親和力的噬菌體單克隆原種培養(yǎng)上清做系列稀釋，與SEB單抗進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果在一定稀釋梯度內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)抑制呈線性上升(Fig 3). 這說明篩選所得短肽與SEB結(jié)合位點(diǎn)與SEB mAb結(jié)合位點(diǎn)一致. 以鼠脾淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，MTT法測(cè)試，SEB在低濃度下，合成的短肽抑制效果較為明顯，隨著SEB濃度的遞增，這種抑制作用逐漸減弱（Fig 4）.2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果幼貓腹腔接種后1 h左右，對(duì)照組出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、精神萎靡、行走困難癥狀；18 h后，幼貓開始飲水進(jìn)食，并恢復(fù)好動(dòng)習(xí)性；而實(shí)驗(yàn)組則無上述癥狀的出現(xiàn). 顯示，合成肽可以保護(hù)幼貓免受SEB腸毒毒性

12、攻擊，證明篩選所得環(huán)狀7肽有效. 為進(jìn)一步證明肽的有效性，將合成的肽與SEB混合進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn). 結(jié)果如Fig 5，秩和檢驗(yàn)2=18.459, P0.05,可認(rèn)為利用肽進(jìn)行保護(hù)組存活率優(yōu)于單純使用DGal SEB組，在用藥后的10 h內(nèi)，這種保護(hù)作用尤為明顯，隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，保護(hù)作用逐漸減弱. 結(jié)果證明，篩選所得肽在一定時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)SEB具有明顯的抑制作用.3討論肽庫技術(shù)是引入組合策略和模擬進(jìn)化思想，建立起的一種篩選藥物先導(dǎo)化合物的新方法. 從噬菌體表位隨機(jī)肽庫中篩選藥物先導(dǎo)化合物，可以快速篩選生物活性肽，這一方法具有傳統(tǒng)的藥物篩選方法無法比擬的優(yōu)越性4.PhageELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，單

13、克隆原種多數(shù)A450 nm比陰性對(duì)照高出910倍，而一般認(rèn)為高出陰性對(duì)照5倍即為陽性，且篩選得到的單克隆序列具有很好的一致性，因此以固相的SEB進(jìn)行親和篩選是成功的，這也與文獻(xiàn)報(bào)道相符5,6. 利用SEB單抗進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制，在一定濃度范圍內(nèi)，抑制效率基本呈線性關(guān)系，這就說明篩選得到的短肽與SEB的結(jié)合位點(diǎn)和單克隆抗體與SEB的結(jié)合位點(diǎn)重疊. 已有實(shí)驗(yàn)證明，SEB可促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖7，而在本實(shí)驗(yàn)中，SEB的超抗原活性體外實(shí)驗(yàn)證明，在一定濃度范圍內(nèi)合成肽可以抑制脾淋巴細(xì)胞的增殖，這就間接證明合成肽對(duì)SEB具有較好的抑制作用,這也與文獻(xiàn)報(bào)道相一致8. 幼貓腹腔實(shí)驗(yàn)顯示，合成肽對(duì)SEB的腸毒活性有較強(qiáng)

14、的抑制作用. 小鼠的致死實(shí)驗(yàn)表明，合成肽可以延緩小鼠死亡時(shí)間，表現(xiàn)出一定保護(hù)作用. 在用藥的10 h內(nèi)，保護(hù)組小鼠沒有出現(xiàn)死亡，而實(shí)驗(yàn)組存活率僅為25%，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，保護(hù)作用的減弱估計(jì)與合成短肽半衰期短，在體內(nèi)不穩(wěn)定，易受體內(nèi)環(huán)境影響發(fā)生降解有關(guān). 【參考文獻(xiàn)】1 雷祚榮著. 葡萄球菌和葡萄球菌素病M. 北京： 中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社,1992: 1992.2 姜永強(qiáng)，寧保安，鄭玉玲,等. 重組葡萄球菌B型腸毒素超抗原的制備及抗腫瘤活性分析J. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2002; 18(4): 323-326.Jiang YQ, Ning BA, Zheng YL, et al. Prepar

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16、98.4 秦鑫，趙寧，張英起，等. 人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽的噬菌體肽庫篩選與鑒定J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004; 25（12）：1117-1119.Qin X, Zhao N, Zhang YQ, et al. Isolation and identification of a novel peptide binding to human transferrin receptor from phage display library J. Fourth Mil Med Univ, 2004;25（12）：1117-1119.5 Goldman ER, Pazirandeh MP, Mauro

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