農(nóng)桿菌感受態(tài)制備

1、m振蕩培pm離 心5 m i體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌DNAra入到200ml EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后，冰浴30min,-70 C放置10min。再在37C水浴5min或42C水浴1min,接著冰浴2min,加入800mlYM液體培養(yǎng)基28C, 175rpm搖培3hr后涂在含50g/mlKan a my c in的YM平板上。2 8 C培養(yǎng)到形成單菌落。其中YM可以用LB代替，第一次的CaCI2溶液可用溶液（）DTT）版本二？EHA105于含50 a g/ m鏈霉素平板劃線,28 C培養(yǎng)。？取1 ag左右的質(zhì)粒普通農(nóng)桿菌感受態(tài)制備與轉(zhuǎn)化:1.挑單菌落于2ml YEP培養(yǎng)基（含Rif20mg/ml）

2、中28C過夜活化。2.取2ml過夜菌液接種于50ml YEP培養(yǎng)基中28C生長至OD6O0勺等于左右(4hr)。?3. 5k rpm離心5分鐘。？4.在10ml NaCI中懸浮細(xì)胞。？5. 5 krpm離心5分鐘，懸浮細(xì)胞于20ml冰預(yù)冷的CaCI2。?如不是馬上使用，可以將之按200ul分裝儲(chǔ)存于-80 C待用。6.加1ug DNA于200ul感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘。？7.液氮中冷凍1分鐘。？8. 37 C水浴溶化細(xì)胞。？9.力口1ml YEP培養(yǎng)基，28C搖床培養(yǎng)2-4hr（低速）。10.離心1分鐘，懸浮細(xì)胞在100ul YEP培養(yǎng)基中。11.涂板，28C培養(yǎng)2-3天。？版本三？農(nóng)

3、桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備？1.挑取少許農(nóng)桿菌LBA4404接種于5ml LB液體培養(yǎng)基（含50mg/L STR）中,28C、200r/mim培養(yǎng)過夜。？2.取2ml培養(yǎng)物于LB液體培養(yǎng)基（含50mg/L STR）中繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD800為左右。？3.將培養(yǎng)物置冰浴中30min,4C、5000r/min、離心5min,棄去上清液。？4.用10ml冷的L NaCl懸浮菌液。？C、5000r/min，離心5min,棄去上清液。？ 6.用1ml冷的CaCI2 (20mmol/L)懸浮，分裝成50卩l(xiāng)/管，液氮中冷凍后至-80 C保存。？農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備:50mM?K-Acetate 30mM?10

4、mM?Glycerol 15% 15ml，定容至100ml。?pH= 121度，高壓滅菌30min。?solutio n2:Rbcl 10mM?K-Acetate 10mM?75mM?Glycerol 15% 15ml，定容至100ml。?pH= 121度，高壓滅菌30min。?2.農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng):15-20ml無抗生素的LB培養(yǎng)基，用牙簽挑取農(nóng)桿菌放入小三角瓶中，28度120轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)過夜。(注意牙簽和小三角瓶均需滅菌)3.制備感受態(tài)農(nóng)桿菌：把已培養(yǎng)過夜的小三角瓶中的農(nóng)桿菌分裝到小離心管中，室溫下，4，OOOg，離心10min。棄去上清，每管加solution1，用手指 彈管1.試劑

5、配制：solution1Rbcl lOOmM?底部，以使菌體懸浮。冰上放置15mim-2h。4度，4，OOOg,?離心10mi n。取出后放在冰上，棄去上清，每管加solutio n2，用手指彈管 底部，以使菌體懸浮，冰上放置15mim分裝 感受態(tài)農(nóng)桿菌，每管可分裝3-4管。用液氮速凍后至-8O C冰箱中保存。版本四？1）從新鮮YEP（5g/LNaCI,1Og/L胰蛋白胨，1Og/L酵母浸出物，1Og/L瓊脂，50mg/L利福平，）平板上挑取農(nóng)桿菌LBA4404的單菌落，接種于5ml液 體YEP培養(yǎng)基（含50mg/L利福平）中，28C 200r/min振搖培養(yǎng)過夜。？ 2）取1ml菌液接種于5

6、0ml液體YEP培養(yǎng)基（含50mg/L利福平）中擴(kuò)大培養(yǎng)，28 C 200r/min振搖培養(yǎng)至OD60（為。?3）冰浴30min,4C 5000r/min離心收集菌體，重懸浮于10ml L NaCl溶液中。？4）再次4C 5000r/min離心收集菌體，重懸浮于1ml 20mmol/LCaCl2溶液中，按200µ/管分裝。制備好的感受態(tài)細(xì)胞若不立即使用， 液氮速凍1min后，放于-70 C冰箱保存，半年內(nèi)使用。版本五？YEB培養(yǎng)基（用于農(nóng)桿菌培養(yǎng)及感受態(tài)制備）蛋白凍（peptone）5g/L?蔗糖（sucrose）5g/L?牛肉膏（Beef extract）1g/L?方法二

7、？1、O/N culture in 10ml of Y EB/Rif 100+Str 100 at 282、1:100 dilution宀grow till OD600=，on ice 30 min;?3、Pellet at 6000rpmfor 20min in precooled centrifuge, then resuspend with 1Vol of precooled H2O;?4、Pellet at 6000rpm for 20min, then resuspend with Vol of precooledH2O;?5、P ellet at 6000rpm for 20mi

8、n, then resus pend with 1/50 Vol of precooled酵母提取物(Yeast extract)5g/L?硫酸鎂(MgSO4?7H2O L?固體培養(yǎng)基加瓊脂粉，高壓滅菌。農(nóng)桿菌電擊感受態(tài)制備？方法一？1、挑取單菌落于YEB振蕩過夜28C培養(yǎng)。？2、以1:200接種于400500mlYEB培養(yǎng)基中（2000ml三角瓶中），搖菌至,冰浴10min。?3、2000g,4 C離心10mi后棄上清，用預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀。？4、3000g,4C離心10min棄上清，用回流甘油重懸沉淀后集中在一管中。5、3000g,4C離心10min棄上清，用回流甘油重懸沉淀。6、50卩1分裝一管，70C保存。？10% glycerol;?6、P ellet at 6000rpm for 20mi n, then resus pend with 1/500 Vol of precooled10% glycerol;?7、Aliquot 80卩l(xiāng). ?農(nóng)桿菌化學(xué)感受態(tài)制備？1、挑取單菌落于YEB振蕩過夜28 C培養(yǎng)；？ 2、1:50接種于50mlYEB培養(yǎng)基中200