植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與遺傳操作

1、 第十章 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與遺傳操作 第一節(jié)原生質(zhì)體研究概況 一、植物原生質(zhì)體的概念 原生質(zhì)體(protoplast):指除去細胞壁的細胞或是說一個被質(zhì)膜所包圍的裸露細胞。 二、植物原生質(zhì)體研究進展 1880 年, Hanstein 首次使用原生質(zhì)體(protoplast) 詞。 I960 年, Cocking 首次應用酶法制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功。 1971 年, Takebe et al. 首次獲得煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株。 1985 年, Fujimura et al. 世界第一例禾谷類作物-水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株。 1986 年, Span ge nberg et al.

2、通過甘藍型油菜單個原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株。 據(jù)統(tǒng)計，目前已有 49 個科，146 個屬的 320 多種植物經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株 (1993)，其中主要以農(nóng)作物和經(jīng)濟作物為主。 第二節(jié)植物原生質(zhì)體分離 植物原生質(zhì)體是去除細胞壁的細胞或是一個被質(zhì)膜包被的“裸露細胞” (見圖 7.1 )，分 離具有活力的原生質(zhì)體是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。早期( 19 世紀末)植物原生質(zhì)體用機械法進行 分離，但易破碎，獲得率低，程序繁瑣，且應用材料有很大局限性，僅限于液泡化程度較高 的細胞或長形細胞組織，如葉片、果實的表皮等。 1960 年，英國植物生理學家 Cocking 首 次用纖維素酶降解番茄幼苗根尖細胞得到原

3、生質(zhì)體， 從而開創(chuàng)了用酶解法分離植物原生質(zhì)體 的新時期。目前用酶解法可從許多植物的任何一部分組織獲得具有活力的原生質(zhì)體。 圖 7.1 植物原生質(zhì)體 產(chǎn)量高、質(zhì)量好、活性強、能進行分裂并形成愈傷組織或胚狀體是原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的 基礎。影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和質(zhì)量的因素很多，主要是基因型、外植體、酶的種類與組合、酶 液的滲透壓、原生質(zhì)膜的穩(wěn)定劑、酶解時間與溫度以及分離與純化方法等。 、基因型與外植體的選擇 一般而言，植物的各個器官如根、莖、葉、果實、種子、子葉、下胚軸及愈傷組織和懸浮培養(yǎng) 細胞都可以作為分離原生質(zhì)體的起始材料。但若要通過原生質(zhì)體培養(yǎng)進行植物品種改良，十分 重要的是基因型的選擇與確定，應從

4、主栽品種和將要推廣品系中選擇合適的基因型。其次是起 始材料的選擇應著重于容易獲得、產(chǎn)量高、質(zhì)量好并易分裂的原生質(zhì)體。紫花苜蓿原生質(zhì)體分 離純化研究表明，在同一種分離純化方法下，不同品種葉片原生質(zhì)體的產(chǎn)量明顯不同。Algonquin 的原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯高于品種 N4,說明基因型是獲取原生質(zhì)體產(chǎn)量高低的關(guān)鍵因素 此外，外植體生理年齡對原生質(zhì)體的產(chǎn)量也有很大影響。 在同一濃度酶液處理下原生質(zhì)體的產(chǎn)量表現(xiàn)不同， 葉片高（見圖 7.3 ）。 meth 2/e nz A meth 1/enz A 不同純化方法對紫花苜蓿不同基因型 N4 和 Algonquin 原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 （引自 Lev 國，et

5、al , 2003） 4 苗齡 圖 7.3 紫花苜蓿品種 Oneida 不同苗齡葉片 對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 分離植物原生質(zhì)體的酶 構(gòu)成植物細胞壁的三個主要成分是： 纖維素，占細胞壁成分的 25%- 50% 半纖 維素，占細胞壁成分的 53%左右； 果膠質(zhì)，占細胞壁成分的 5%左右。因此，分離植物 原生質(zhì)體的酶有三種，即纖維素酶、 半纖維素酶和果膠酶。一般認為原生質(zhì)體的分離， 纖維 （見圖 7.2 ）。 紫花苜蓿品種 Oneida 的不同苗齡葉片， 3 周苗齡葉片原生質(zhì)體的產(chǎn)量要比 4 周苗齡 meth 3/enz A 純化方法 周 3 周 iXmz AiXmz A SX szASX szA B

6、 B s s M 苗 山 素酶和果膠酶是必要的。但對有些植物材料，還要加入半纖維素酶。酶液的濃度（見圖 7.3 和圖 7.4 ）和分離純化方法（見圖 7.4 ）對原生質(zhì)體產(chǎn)量有明顯影響。酶液濃度較高時，處 理同一品種同一外植體獲得原生質(zhì)體的產(chǎn)量較高。 圖 7.4 酶液濃度對紫花苜蓿品種 N4 葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 (引自 Lev 國，et al , 2003) 3. 滲透壓的穩(wěn)定劑 合適的滲透壓是保證原生質(zhì)體完整性的前提。細胞去壁后獲得的原生質(zhì)體只有質(zhì)膜包 被，所以，它的穩(wěn)定性必須通過調(diào)節(jié)滲透壓來維持， 否則分離出的原生質(zhì)體容易破碎或萎縮。 常用的穩(wěn)定劑有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖

7、等，濃度一般為 0.40.6 mol/L , 加入酶液、洗液和培養(yǎng)基中。為提高原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性，常加入 CaCl2 (50100 mmol/L )、 KHPQ、MES(2嗎啡啉乙基磺酸)、葡聚糖、硫酸鉀，從而提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。 4. 原生質(zhì)體的游離 (1)材料的預處理 暗處理、預培養(yǎng)及低溫處理可提高原生質(zhì)體的分裂率。 研究表明，對于龍膽試管苗的葉 片，只有用 4P 低溫處理后得到的原生質(zhì)體才能分裂；甘蔗必須先在黑暗條件下培養(yǎng) 12 h , 分離的原生質(zhì)體才能分裂； 萬苣只有在分離前于誘導愈傷組織的培養(yǎng)基上預培養(yǎng) 2 周，分離 的原生質(zhì)體才能分裂。 (2 )材料的滅菌處理 除試管苗、愈傷

8、組織、培養(yǎng)細胞不用滅菌外，其他材料均需滅菌。如果以葉片和子葉為 游離原生質(zhì)體的起始材料，則需去上表皮，即葉片晾干后用解剖鑷子撕去上表皮。 應將去表 皮的一面朝下放入酶液中，或用解剖刀切成小細條加入酶液中。 (3 )酶解處理 植物材料與酶液按一定的比例混合， 一般每克材料加 1020 mL 酶液。葉片需要酶液較 少，而懸浮細胞需要酶液較多。加入酶液后，在 25 乜條件下，靜止于黑暗中酶解，并間隔 輕搖。如果起始材料為懸浮培養(yǎng)細胞或愈傷組織， 則需在低速搖床上搖動酶解。酶解過程中 應經(jīng)常觀察、檢查，并及時調(diào)節(jié)滲透壓，避免原生質(zhì)體破裂或萎縮。 5.原生質(zhì)體的收集和純化 原生質(zhì)體純化最常用的方法是過濾

9、和離心相結(jié)合(見圖 體。圖 7.6為紫花苜蓿葉片分離純化的原生質(zhì)體。 500 r/min | 一一訊去上清 - 1 5 min I - - 500 r/min 1 5 min 重復3次 500 r/min 培養(yǎng)基 門5 min 重懸原生質(zhì)體 7.5 ),分離純化后獲得原生質(zhì) 洗液重懸原 生質(zhì)體 去上清 * 力加培養(yǎng)基使原生 質(zhì)體密度為 1 X 104 1 X 106 個/mL 原生質(zhì)體混合液140100呦 - 1過濾 崛!去上清 圖 7.5 原生質(zhì)體收集純化流程圖 Al 廣.jQ 0 八H r 冷八仁口 圖 7.6 紫花苜蓿葉片分離純化的原生質(zhì)體 （引自 Lev 國,et al , 2003）

10、 6.原生質(zhì)體活力鑒定 一般采用 FDA 染色法（熒光素雙醋酸酯） 鑒定原生質(zhì)體有無活力。 取純化后的植物原生 質(zhì)體懸浮液 0.5 mL 置于小試管中，加入含 2 mg/L FDA 的丙酮溶液，使最終濃度變?yōu)?0.01%, 混勻，放置 5 分鐘。用熒光顯微鏡觀察（激發(fā)光濾光片 QB-24、壓制濾光片 JB-8），有活力 原生質(zhì)體發(fā)綠色熒光，不產(chǎn)生熒光為無活力。對于葉肉、子葉、下胚軸而言，由于葉綠素的 關(guān)系，原生質(zhì)體發(fā)黃綠色熒光的為有活力的， 發(fā)紅色熒光的為無活力的。此外，還可用細胞 壁染色法來鑒定活力（許智宏，衛(wèi)志明， 第三節(jié)植物原生質(zhì)體培養(yǎng) 原生質(zhì)體培養(yǎng)基的選擇 原生質(zhì)體培養(yǎng)基與細胞培養(yǎng)基相

11、似， 在細胞培養(yǎng)基上進行改良。 禾谷類植物原生質(zhì)體的 培養(yǎng)基多以 MS N6等為基本培養(yǎng)基；十字花科和豆科則多為 &、KM K8p、KM8p 茄科的基 本培養(yǎng)基為 MS NT K3 （許智宏，衛(wèi)志明，1997）。 2. 滲透壓穩(wěn)定劑 培養(yǎng)基中常加一定濃度的滲透壓穩(wěn)定劑來保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。 常用的穩(wěn)定劑為甘露 醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖。研究表明，葡萄糖是原生質(zhì)體培養(yǎng)最理想的滲透壓穩(wěn) 定劑和碳源，有利于原生質(zhì)體的生長、細胞壁的再生、再生細胞的分裂和細胞團的增殖，并 維持細胞的持續(xù)分裂直至形成細胞團，使用濃度為 0.40.5 mol/L。但隨著細胞壁的再生 和細胞的持續(xù)分裂，滲透

12、劑的濃度需不斷降低才有利于培養(yǎng)物的生長。 一般通過添加新鮮培 養(yǎng)基的方法，每 12 周使?jié)B透劑的濃度降低 0.050.1 mol/L 。 3. 無機鹽 用于原生質(zhì)體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，大量鹽濃度應比細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基低。大量元素中鈣 離子和 NH：對原生質(zhì)體培養(yǎng)影響最大， 較高的鈣離子可提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。 因此，在 很多植物培養(yǎng)中用 1/2 MS 培養(yǎng)基（鈣離子保持 MS 培養(yǎng)基中原有濃度）。 氮源是植物生長不可缺少的營養(yǎng)，但研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的 NH 了對原生質(zhì)體生長發(fā)育不 利。Upadhya （1975）首先報道，NH 了抑制馬鈴薯原生質(zhì)體的生長。 Von Arnold 和 Erikson （

13、1977）證明，當 NH 丁的濃度高于 2 000 mg/L 時，可使豌豆的原生質(zhì)體致死； Oka 和 Ohyana （1985）在構(gòu)樹原生質(zhì)體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，高濃度的 NH J 原生質(zhì)體壞死，只有把 MS 培養(yǎng)基中 的 NH；和 NO 廠 度降到 200 mg/L 時，原生質(zhì)體才能正常發(fā)育。因此，很多原生質(zhì)體培養(yǎng) 中常采用有機氮氮源取代銨鹽。但在小麥原生質(zhì)體培養(yǎng)中，起始培養(yǎng)基中的 NH 了較低，在 添加新鮮培養(yǎng)基時適當增加 NHJN 可促進細胞分裂和提高植板率。所以，培養(yǎng)基中氮源 種類和濃度應依植物種類和材料經(jīng)試驗后確定。9么聲二八 強A 1997）。 4. 有機物 在原生質(zhì)體的培養(yǎng)基中添加一定

14、量的 炭、酵母提取物和椰乳等，對促進細胞分裂和胚狀體形成都有良好作用。 5.8 。 5. 激素 二、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法 1. 固體培養(yǎng)法 固體培養(yǎng)法是指純化后懸浮在液體培養(yǎng)基中的原生質(zhì)體懸液與熱融并冷卻至 45 七的含 瓊脂糖的培養(yǎng)基等量混合，并迅速輕搖， 混勻，冷卻后原生質(zhì)體被埋在固體培養(yǎng)基中。這種 方法的優(yōu)點是便于定位觀察、追蹤單個原生質(zhì)體再生細胞的發(fā)育進程， 避免細胞間有害代謝 產(chǎn)物的影響。瓊脂糖是一個良好的培養(yǎng)基凝膠劑，可促進原生質(zhì)體再生細胞的分裂。 2. 液體培養(yǎng)法 23 mL 于三角瓶或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)， 初期每天輕輕 這種方法的優(yōu)點是操作簡便，對原生質(zhì)體傷害小； 而且分布不均勻，易造成

15、局部原生質(zhì)體密度過高或粘聚， 影 響再生細胞的分裂和進一步生長發(fā)育。 ABA 多胺類、對甲氧基苯甲酸、小牛血清、活性 培養(yǎng)基 pH 值為 5.6 植物激素是原生質(zhì)體培養(yǎng)的重要因素。激素種類和濃度因培養(yǎng)物種而異。 生長素和細胞分裂素是必需的， 而且在不同生長發(fā)育階段（起始階段， 織形成以及器官發(fā)生、胚狀體發(fā)生及發(fā)育成苗階段） ，需不斷適時調(diào)整激素的種類和濃度。 培養(yǎng)基中加 2, 4-D 可促進細胞啟動分裂、持續(xù)分裂和愈傷組織形成，有時需將 2, 4-D 與 NAA 或 BA 或 ZT 配合使用，才有利于原生質(zhì)體的發(fā)育（見圖 7.7 ）。隨著培養(yǎng)進程，愈傷 組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基時，應逐漸降低 量增加

16、 BA 或 ZT 濃度以促進芽的分化。 但總的而言， 細胞團形成、愈傷組 2, 4-D 或去除 2, 4-D，降低 NAA 或用 IAA 取代，并適 0.38M glucose+Kao 0.45M glucose+Hb Mix+Hb 4 5 種不同碳源和 0.4 M，0.45 M 周 MS 基本培養(yǎng)基處理，碳源為葡萄糖 0.4M、蔗糖 0.09M 和甘露醇 0.1M 0.38M glucose+Hb 2 種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的 和 0.6 M ）或葡萄糖 調(diào)節(jié)物質(zhì)為 Hb: 2 mg/L NAA 0.5 mg/L 2, 4-D, 0.5 mg/L zeatin ; Kao： 0.2 mg/L 2,

17、4-D, 0.5 mg/L BA（ Kao, et al , 1975）。原生質(zhì)體最佳發(fā)育的組合為 glucose + Hb 和 0.38M glucose + Kao, 4 周后 20%以上原生質(zhì)體發(fā)育成細胞團。 圖 7.7 碳源和生長調(diào)節(jié)劑對紫花苜蓿原生質(zhì)體發(fā)育的影響 （引自 Lev 國,et al , 2003） 45M glucose+Kao 1 mg/LNAA 0?45hMix+Kao 常用液體淺層培養(yǎng)法和懸滴培養(yǎng)法。 液體淺層培養(yǎng)法是將原生質(zhì)體懸浮液 搖動 23 次，以防止原生質(zhì)體沉積皿底。 缺點是不易定位觀察原生質(zhì)體， 懸滴培養(yǎng)法指用刻度滴管取原生質(zhì)體培養(yǎng)液以 50100 PL

18、的小滴分開接種在無菌干燥的 培養(yǎng)皿皿蓋“反面”上，且以滴間不相碰為準，底皿加保濕液，將皿蓋蓋于底皿上，封口培養(yǎng)。 這種方法的優(yōu)點是材料少,生長快,不易污染,易加入培養(yǎng)基,有利于低密度培養(yǎng)；缺點與液 體淺層培養(yǎng)法相同（許智宏,衛(wèi)志明, 1997）。 3. 固液結(jié)合培養(yǎng)法 固液結(jié)合培養(yǎng)法即雙層培養(yǎng)法， 指在底皿先鋪一層固體培養(yǎng)基， 其上進行原生質(zhì)體的液 體淺層培養(yǎng)。 4. 念珠培養(yǎng)法 念珠培養(yǎng)法是指將含有原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基切成塊，放在體積大的液體培養(yǎng)基中， 并在旋轉(zhuǎn)搖床上進行振蕩的培養(yǎng)方法（ Shillit ， et al ， 1983）。 三、原生質(zhì)體再生植株 1. 通過器官形成途徑再生植株

19、 原生質(zhì)體培養(yǎng)植株再生多數(shù)是通過器官形成途徑再生植株。 特別是在雙子葉植物中， 茄 科、菊科和十字花科的大多數(shù)以及豆科的相當一部分種的原生質(zhì)體培養(yǎng)， 都通過器官形成途 徑再生植株。 由原生質(zhì)體培養(yǎng)到器官分化直至形成完整植株， 每一培養(yǎng)階段所需培養(yǎng)基不同， 一般需要三種培養(yǎng)基，即原生質(zhì)體培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基， 而且培養(yǎng)基不同，激 素成分和滲透壓也隨之改變。 （1）原生質(zhì)體培養(yǎng)基 原生質(zhì)體培養(yǎng)基用來促進原生質(zhì)體再生細胞壁和單細胞分裂，形成細胞團或小愈傷組 織。培養(yǎng)基內(nèi)通常含有植物激素、糖類物質(zhì)、 無機鹽和維生素，還應含有維持原生質(zhì)體穩(wěn)定 性的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)，如甘露醇、山梨醇或葡萄糖等。

20、（ 2 ）分化培養(yǎng)基 分化培養(yǎng)基主要用來誘導芽的形成， 不再含有滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)， 而且應降低生長素濃度， 同時加入較高濃度細胞分裂素。 如果原生質(zhì)體開始階段在液體或軟瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，則此時應轉(zhuǎn)到用瓊脂、瓊脂糖或 Gelrite 固化的培養(yǎng)基上（許智宏，衛(wèi)志明， （ 3 ）生根培養(yǎng)基 生根培養(yǎng)基用以誘導再生苗生根，再生完整植株。對多數(shù)植物而言，培養(yǎng)基內(nèi)生長素 （lAA、NAA 或 IBA）濃度通常較低，不含細胞分裂素。對某些植物而言，根的誘導無需添加 任何植物激素。 2. 通過胚胎發(fā)生途徑再生植株 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)通過胚胎發(fā)生途徑再生植株的植物種類，主要集中在禾本科、傘形 花科、蕓香科、葫蘆科和豆科中的一部分（尤其是豆科牧草，如紫花苜蓿，見圖 7.8 ）等。 而茄科植物中絕大多數(shù)種原生質(zhì)體培養(yǎng)通過器官途徑再生植株， 僅有少數(shù)種通過體細胞胚 胎途徑再生植株。 植物由原生質(zhì)體培養(yǎng)到誘導體細胞胚胎發(fā)生直至植株再生，與器官形