培哚普利對U937泡沫細胞血管內皮生長因子表達的影響

1、培哚普利對U937泡沫細胞血管內皮生長因子表達的影響        【摘要】  目的：研究培哚普利對氧化修飾的低密度脂蛋白(oxLDL)誘導的U937泡沫細胞血管內皮生長因子(VEGF)mRNA、蛋白表達的影響。方法: U937細胞與80 g/L oxLDL孵育48 h，建立U937泡沫細胞模型，以不同濃度的培哚普利（0.01、0.10、1.00 mol/L）預處理U937細胞24 h再加入80 g/L 的oxLDL孵育48 h，通過逆轉錄聚合酶鏈式擴增反應(RTPCR)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分

2、別檢測U937細胞VEGF mRNA和蛋白的表達情況。 結果： U937泡沫細胞組VEGF mRNA的表達較U937細胞對照組明顯增加（2.371±0.253）vs（0.954±0.245）（P<0.01），培哚普利干預后，隨著濃度（0.01、0.10、1.00 mol/L）的增加，U937泡沫細胞的VEGF mRNA表達水平呈濃度依賴性下降（2.168±0.270）vs（1.533±0.248）vs（1.022±0.189）（P<0.01）；U937泡沫細胞組VEGF蛋白表達較U937細胞對照組明顯增加（1 804.18±

3、;177.59） pg/mL vs （716.19±60.82） pg/mL（P< 0.01）,培哚普利干預后，隨著濃度（0.01、0.10、1.00 mol/L）的增加，U937泡沫細胞VEGF蛋白表達呈濃度依賴性降低（1 601.46±154.68） pg/mL vs （1 377.09±110.36） pg/mL vs （1 017.89±147.18） pg/mL（P<0.01）。結論: 培哚普利能夠濃度依賴性地下調oxLDL誘導的U937泡沫細胞VEGF mRNA、蛋白的表達。 【關鍵詞】  培哚普利；泡沫細胞；血管內皮生

4、長因子    ABSTRACT Objective: To study the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) induced by oxidized low density liprotein (oxLDL) and the inhibitory effects of perindopril on the levels of VEGF protein and mRNA in the U937 foam cells.Methods: The U937 cells were incuba

5、ted with oxLDL 80 g/mL for 48 h and a macrophagederived foam cell model was established. The medium was pretreated with perindopril (0.01、0.1、1 mol/L) for 24 h , incubated with oxLDL 80 g/mL for 48 h.Reverse transcriptionpolymerase chain reaction(RTPCR) and enzymelinked immuneosorbent assay (ELISA)

6、were applied to determine the expression of VEGFprotein and mRNA in U937 cells and treated U937 cells.Results: VEGFmRNA levels in U937 cells after incubation with oxLDL 80 g/mL increased significantly compared with control cells(foam cells vs control cells, 2.371±0.253 vs 0.954±0.245, P<

7、;0.01).After treated with perindopril(0.01、0.10、1.00 mol/L), VEGF protein levels were concentrationdepently attenuated(foam cells vs perindopril treated cells, 2.371±0.253 vs 2.168±0.270、1.533±0.248、1.022±0.189, P<0.01). VEGF protein levels in the medium after incubation with

8、oxLDL 80 g/mL increased significantly compared with control cells(foam cells vs control cells , 1 804.18±177.59 pg/mL vs 716.19±60.82 pg/mL, P<0.01).After treated with perindopril(0.01, 0.10, 1.00  mol/L), VEGF protein levels were concentrationdepently attenuated(foam cells vs peri

9、ndopril treated cells, 1 804.18± 177.59 vs 1 601.46±154.68 pg/mL, 1 377.09±110.36 pg/mL, 1 017.89±147.18 pg/mL, P<0.01). Conclusion: Perindopril can signifantly attenuated VEGF mRNA and protein expression in foam cells.    KEY WORDS Perindopril ； Foam cells ； Va

10、scular endothelial growth factor    動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是常見的危害嚴重的心血管疾病。泡沫細胞是動脈粥樣硬化斑塊內出現(xiàn)的特征性病理細胞，一般認為在動脈粥樣硬化形成的早期,血液中的單核細胞進入內皮下間隙,在內膜下被激活后分化為巨噬細胞,后者主要通過清道夫受體無反饋性下調地吞噬大量氧化修飾的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL),導致細胞內脂質堆積，形成泡沫細胞。研究表明斑塊內巨噬泡沫細胞分泌的血管內皮生長因子（vascular endotheli

11、al growth factor，VEGF）可促進斑塊內血管新生（angiogenesis），而血管新生與斑塊的生長、破裂、出血及血栓形成關系密切1。本研究通過氧化低密度脂蛋白誘導體外培養(yǎng)的人單核/巨噬細胞系U937細胞成泡沫細胞,觀察VEGF在泡沫細胞中的表達情況及培哚普利對其表達的影響。    1  材料與方法    1.1  實驗材料    人單核/巨噬細胞系U937細胞（上海午立生物技術有限公司），培哚普利（天津施維雅制藥有限公司），胎牛血清（杭州四季青公司），低密度脂蛋白（L

12、DL，醫(yī)學院基礎研究所），Trizol試劑（Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒（晶美公司），Taq酶、10×PCR反應緩沖液、dNTPs、6×溴酚藍上樣緩沖液、DNA marker（Takara公司），VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（R&D Systems公司）。    海南醫(yī)學院學報 Vol.15 No.1 Feb.20091.2  LDL的氧化修飾    取0.9 mg/mL的LDL 1 mL放入0.01 mol/L的PBS 100 mL（pH 7.4）中4 透析24

13、h，以除去離心過程中所加的抗氧化劑，用PBS將LDL稀釋至蛋白濃度為0.5 mg/mL，放入新鮮配制的含10 mol/L CuSO4 的PBS溶液中37 孵育氧化1224 h，然后放入含1 mol/L EDTA的PBS（pH 7.4）中4 透析24 h，以終止氧化還原反應。測定oxLDL丙二醛（ MDA）的含量為31.97 nmol/L（MDA藥盒），鑒定其氧化修飾程度。將制備好的oxLDL以0.22 m濾膜過濾除菌，4 保存。將上述最終反應物用無血清無酚紅1640定容至9 mL，配制成80 g /mL的oxLDL溶液備用。    1.3  U937泡沫

14、細胞模型的建立和分組    將人單核/巨噬細胞系U937細胞懸浮生長于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，放入37 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液傳代一次,至細胞密度達1.0×109個/ L，將培養(yǎng)細胞分為U937細胞對照組、U937泡沫細胞組及3種劑量的藥物干預組。U937細胞對照組：U937細胞中除加RPMI 1640培養(yǎng)液外，不加其它任何藥物；U937泡沫細胞組：RPMI 1640洗2遍，換入無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，同時加入oxLDL至終濃度80 g/mL培養(yǎng)48 h，使U937細胞泡沫化。藥物干預組：U937細胞用

15、RPMI 1640洗2遍后分別加入0.01、0.10、1.00 mol/L 不同濃度的培哚普利液中，在溫箱中37 溫育24 h，再加入濃度80 g/mL的oxLDL孵育 48 h。處理后的各細胞組及亞組分別采用逆轉錄聚合酶鏈式擴增反應（RTPCR）方法檢測細胞VEGF mRNA表達及ELISA方法檢測細胞上清液VEGF蛋白水平，每組重復檢測6次。    1.4  U937泡沫細胞油紅染色    收集細胞低速離心制成細胞懸液，涂于干凈的被有1%明膠的玻片上，晾干。在4%的甲醛中固定12 h 后以新鮮配制的0.3% 油紅O染色2

16、0 min，再以氧化蘇木精襯染2 min，然后以丙酮脫水12 s后PVP封片。各步驟間均用雙蒸水沖洗干凈。胞漿內出現(xiàn)紅染顆粒的為脂質染色陽性。    1.5  RTPCR檢測細胞VEGF mRNA的表達    采用逆轉錄試劑盒以Trizol試劑一步法抽提細胞RNA并定量，各樣本均加入總RNA 2 g，逆轉錄合成第一鏈cDNA。cDNA擴增聚合酶鏈反應，引物：VEGF上游 5GGACATCTTCCAGGAGTA3，下游5TGCAACGCGAGTCTGTGT3，擴增產(chǎn)物356 bp；內參actin 上游5ATCGTGCGTGAC

17、ATTAAGG 3， 下游5ACAGGACTCCATGCCCAGG3，擴增產(chǎn)物195 bp。逆轉錄酶鏈反應條件：94 30 ，58 30 ，72 45 ，35個循環(huán)。反應完成后用含有5 mg/L 溴化乙錠的1.5 % 瓊脂糖凝膠對RTPCR反應產(chǎn)物進行電泳，用數(shù)字成像系統(tǒng)進行分析和拍照。    1.6  ELISA檢測細胞上清液VEGF蛋白水平    采用雙抗體夾心法，按照試劑盒操作步驟，以RPMI 1640培養(yǎng)液為空白對照，將不同濃度的VEGF標準品（2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.5 pg

18、/mL），在酶標儀上波長為450 nm波段測定光密度值，以VEGF標準品濃度為橫坐標、光密度值為縱坐標進行直線相關回歸，根據(jù)待測標本的光密度值在直線上查出相應的VEGF蛋白水平。    1.7  統(tǒng)計學處理    所有計量資料均用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)處理用單因素方差分析，檢驗水準a= 0.05。    2  結果    2.1  U937泡沫細胞模型的建立  

19、60; U937細胞長至1×106/mL后用80 g/mL的oxLDL刺激48 h，油紅O染色后光鏡下可見細胞胞漿內存在大量的脂滴，符合泡沫細胞的形態(tài)特征， U937泡沫細胞模型建立。    2.2  U937細胞VEGF mRNA表達的變化    oxLDL刺激U937細胞48 h成為U937泡沫細胞后，VEGF mRNA的表達較U937細胞對照組明顯增加（P<0.01）。采用不同濃度的培哚普利干預U937泡沫細胞后，其VEGF mRNA表達水平呈濃度依賴性下降，較U937泡沫細胞組差異有統(tǒng)計學意義（P&l

20、t;0.050.01）,不同濃度培哚普利組間差異亦有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（表1）。不同濃度培哚普利處理U937細胞后RTPCR檢測VEGF mRNA的結果見圖1。    2.3  U937細胞上清液VEGF蛋白水平的變化    與U937細胞對照組相比，U937泡沫細胞組VEGF蛋白表達水平增加了1.52倍，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。采用不同濃度的培哚普利干預U937泡沫細胞后，VEGF蛋白水平呈濃度依賴性下降，較U937泡沫細胞組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.050.01）,不同濃度培哚普利組間

21、差異亦有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（表2）。表1  各組U937細胞VEGF mRNA表達的變化注：與U937細胞對照組比較，*P< 0.01；與U937泡沫細胞組比較，P<0.05，P<0.01；與0.01 mol/L培哚普利組比較，P<0.01；與0.10 mol/L培哚普利組比較，P<0.01。 表2  各組 U937細胞上清液VEGF蛋白水平 的變化 注：與U937細胞對照組比較，*P<0.01；與U937泡沫細胞組比較，P<0.05，P <0.01；與0.01 mol/L培哚普利組比較，P <0.01；與

22、0.10 mol/L培哚普利組比較，P<0.01。    3  討論    研究表明， oxLDL是動脈粥樣硬化的獨立危險因子，在動脈粥樣硬化過程中起著關鍵作用2。oxLDL作為氧化信號使巨噬細胞中接受氧化物成分的轉錄因子激活，刺激包括VEGF在內的一系列細胞因子及生長因子表達，誘導單核細胞粘附于動脈內皮并分化為巨噬細胞，巨噬細胞清道夫受體大量攝取oxLDL而不受胞內膽固醇含量的影響，導致體內膽固醇蓄積，最終促進單核/巨噬細胞轉變?yōu)榕菽毎瑹o疑促進了動脈粥樣硬化的發(fā)生3，4。泡沫細胞的形成貫穿了動脈粥樣硬化發(fā)生、的整

23、個過程，泡沫細胞分泌的炎性細胞因子和生長因子對于斑塊的穩(wěn)定性有重要的作用 。1             VEGF與斑塊內的血管新生有密切關聯(lián)。VEGF是Ferrara等5從腦垂體濾泡星狀細胞培養(yǎng)液中提取的一種能與肝素結合的二聚體糖蛋白，這種蛋白對血管內皮細胞有特異性分裂增殖的作用。VEGF作為一種特異的內皮細胞絲裂原分裂蛋白，可引起血管系統(tǒng)和一系列病理過程，包括腫瘤生長、傷口愈合和糖尿病視網(wǎng)膜病變的6。VEGF在正常血管上無表達，但主要存在于人動脈粥樣硬化損害部位，在早期動脈粥樣硬化損

24、害中，VEGF多存在于內皮下巨噬細胞豐富的部位。在粥樣斑塊中，檢測到VEGF存在于由脂質豐富的巨噬細胞組成的粥樣損害中央和主要由平滑肌細胞組成的斑塊基底部1。Celletti等7將新西蘭大白兔高脂喂養(yǎng)3個月，單獨肌肉內注射VEGF，721 d后取兔胸主動脈進行形態(tài)學和免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)注射VEGF組兔的平均斑塊面積、斑塊周長、最大斑塊厚度、內皮密度（內皮占斑塊厚度的比率）以及巨噬細胞密度均較注射白蛋白組（對照組）有非常顯著性增加，從而提示VEGF能增加高脂喂養(yǎng)的兔胸主動脈動脈粥樣硬化斑塊形成的程度和數(shù)量。Inoue等8發(fā)現(xiàn)oxLDL可使THP1、U937等單核巨噬細胞及人冠狀動脈內皮細胞的VE

25、GF mRNA及蛋白表達增加，并指出該作用是通過激活細胞過氧化物增殖體激活受體信號來實現(xiàn)的。此外，血管緊張素（angiotensin，Ang）、高葡萄糖、高同型半胱氨酸均可誘導血管平滑肌細胞、單核巨噬細胞表達VEGF911 ，說明VEGF參與了動脈粥樣硬化有關的危險因素，如高血脂、高血壓、高血糖、高同型半胱氨酸血癥導致動脈粥樣硬化的過程。    U937細胞是一種人單核/巨噬細胞株，常用于動脈粥樣硬化發(fā)病機制的研究，用oxLDL刺激U937細胞可制作可靠、穩(wěn)定的單核/巨噬細胞源性泡沫細胞模型12。該泡沫細胞模型避免了個體差異,也避免了從人體取材原代細胞培養(yǎng)的麻煩，

26、能為研究泡沫細胞提供大量穩(wěn)定可靠的細胞材料。U937細胞無經(jīng)典的A類清道夫受體，但存在B類清道夫受體CD36。本實驗用80 g/mL oxLDL刺激U937細胞48 h，通過油紅O染色發(fā)現(xiàn)泡沫細胞形成。用Trizol一步法抽提細胞的總RNA并進行RTPCR發(fā)現(xiàn)經(jīng)oxLDL刺激后形成的U937泡沫細胞VEGF mRNA表達較對照細胞組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義。夾心抗體酶聯(lián)免疫定量法檢測VEGF蛋白表達量發(fā)現(xiàn)，與U937細胞對照組相比，U937泡沫細胞組VEGF蛋白水平升高了1.52倍，差異有統(tǒng)計學意義。本實驗的oxLDL對單核/巨噬細胞VEGF mRNA及蛋白表達的影響與以往的報道相符。以往的

27、報道多是單純的從單核/巨噬細胞、平滑肌細胞、內皮細胞角度來考慮的，而本研究則是從泡沫細胞角度來觀察VEGF的表達情況。泡沫細胞是動脈粥樣硬化的重要特征，泡沫細胞的VEGF表達可能更具有病理意義。本實驗提示了oxLDL誘導的泡沫細胞VEGF表達可能在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中起一定作用。    Ang能促使動脈粥樣硬化斑塊形成，血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）可抑制Ang生成從而具有抗動脈粥樣硬化的作用。ACEI還具有穩(wěn)定斑塊作用，動物實驗表明它不僅能降低斑塊體積，還能減少巨噬細胞聚集發(fā)生率和增加細胞外基質，但這種有益的效應不能完全用降血壓作用來解釋。HOPE試

28、驗結果表明，ACEI雷米普利能顯著減少高危冠心病病人的心血管不良事件，提示雷米普利具有抗炎、穩(wěn)定斑塊的作用。EUROPA也揭示了培哚普利防治冠心病的作用，能顯著減少主要終點事件（心血管死亡、急性心肌梗死和血運重建）。EUROPA亞組研究（PERTINENT）進一步闡明了培哚普利的可能機制13：（1）減少Ang和腫瘤壞死因子a（TNF）水平；（2）顯著增加緩激肽水平；（3）上調內皮型一氧化氮合酶（eNOS）的活性并降低內皮細胞凋亡率；（4）降低血管性血友病因子（VWF）水平。本實驗結果發(fā)現(xiàn)oxLDL刺激的U937泡沫細胞VEGF mRNA及蛋白水平表達顯著增加。在加入ACEI培哚普利后，隨著濃度

29、（0.01、0.10、1.00 mol/L）的增加，U937泡沫細胞表達VEGF mRNA及蛋白逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義。本實驗證實了培哚普利體外干預泡沫細胞可從轉錄、翻譯角度呈濃度依賴性降低VEGF表達水平，培哚普利有可能通過降低泡沫細胞VEGF的表達來發(fā)揮動脈粥樣硬化、穩(wěn)定斑塊的作用。Murakami等14報道急性心肌梗死發(fā)作36 h內給予培哚普利或坎地沙坦，并不能顯著降低外周血VEGF水平。本研究與該報道不同，原因可能為急性心肌梗死具有嚴重的缺血缺氧，而缺氧是VEGF表達的強刺激，VEGF表達對缺血心肌側枝循環(huán)的建立有幫助，是一種代償性保護機制，可能ACEI降低泡沫細胞VEGF的程度不

30、足以抵消外周血VEGF升高的程度?！尽?#160; 1 Ramos MA, Kuzuya M, Esaki T, et al. Induction of macrophage VEGF in response to oxidized LDL and VEGF accumulation in human atherosclerosis lesionsJ. Arter Thromb Vasc Biol,1998, 18(7) : 188196.2 Jialal I, Devara JS.The role of oxidized low density lipoprotein in atherogenesisJ. Nutrition,1996, 126(8):10531057.3 林秋雄，余細勇，單志新，等.氧化型低密度脂蛋白誘導巨噬細胞移動抑制因子的表達J.病理生理雜志,2004，20（10）：17941797.4 Moulton KS, Heller E, Konerding MA, et al.Angiogenesis inhibitors endostatin or TNP470 reduce intimal neovascularization and plaque