新城雞瘟病毒修飾自體腫瘤細(xì)胞疫苗在28例中晚期宮頸癌的應(yīng)用

1、新城雞瘟病毒修飾自體腫瘤細(xì)胞疫苗在28例中晚期宮頸癌的應(yīng)用        【摘要】     目的 探討新城雞瘟病毒修飾自體腫瘤細(xì)胞疫苗(NDV-ATV)在中、晚期宮頸癌治療中的作用。方法 28例宮頸癌行NDV-ATV免疫治療和放射治療（實(shí)驗(yàn)組），30例單純接受放射治療（對(duì)照組）。采用流式細(xì)胞術(shù)觀察患者在接受免疫治療前后外周血中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值變化以及放射治療的近期療效、毒副反應(yīng)等。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組28例中、晚期宮頸癌患者經(jīng)治療12個(gè)療程后，其C

2、D4+、CD4+/CD8+比值較治療前顯著增加（P0.05)，同時(shí)CD8+數(shù)量較治療前降低(P0.05)，放射治療近期療效較對(duì)照組好（P0.05)，毒副反應(yīng)輕。結(jié)論 新城雞瘟病毒修飾自體腫瘤細(xì)胞疫苗能增強(qiáng)患者免疫功能，對(duì)放射治療有協(xié)同作用。     【關(guān)鍵詞】  新城雞瘟病毒 自體疫苗 免疫功能 宮頸腫瘤        Application of New castle Disease Virus-Modified Autologous Tumor Vaccine in 28

3、 Cases with Advanced Cervical Carcinoma    JIANG Lian-ping, ZHAO Yu-ping, WANG Yi    (The Second Peoples Hospital in Wenzhou, Wenzhou Tumor Hospital, Wenzhou 325000, China)    Abstract: Purpose To explore the role of New castle disease virus-modified auto

4、logous tumor vaccine(NDV-ATV) for treating advanced cervical carcinoma. Methods Twenty-eight cases with cervical carcinoma underwent NDV-ATV immunotherapy combined with radiotherapy (experimental group), and 30 cases underwent radiotherapy alone(control group). The changes of CD4+, CD8+ and CD4+/CD8

5、+ in the peripherical blood were measured by flow cytometry. Short-term effects of radiotherapy and its side effects were investigated. Results After one to two courses of the therapy for 28 cases with advanced cervical carcinoma, the levels of CD4+ and ratio of CD4+/CD8+ significantly increased tha

6、n those before treatment (P0.05）, and CD8+ significantly decreased than that before the therapy (P0.05）. The short-term effects of radiotherapy in experimental group was better than that in control group (P0.05） with mild side effects in former group. Conclusions New castle disease virus-modified au

7、tologous tumor vaccine (NDV-ATV) enhances the immunity in cervical carcinoma and synergistically with radiotherapy.    Key words: New castle disease virus; autologous tumor vaccine; immunologic function; cervical neoplasms    進(jìn)入21世紀(jì)，以免疫治療為代表的生物治療已成為腫瘤治療的第四種模式。其中腫瘤的主動(dòng)免疫治

8、療是指給機(jī)體輸入具有抗原的疫苗，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤免疫以治療腫瘤的方法。新城雞瘟病毒修飾自體腫瘤細(xì)胞疫苗（New castle disease virus?鄄modified autologous tumor vaccine，NDV?鄄ATV）對(duì)惡性腫瘤的放射治療具有協(xié)同作用，本文探討其在宮頸癌治療中的價(jià)值。    1   材料與方法    1.1   一般資料    對(duì)2004年5月到2006年1月收治的B期以上宮頸癌患者行放射治療+NDV?鄄ATV治療共

9、28例為實(shí)驗(yàn)組；與同期住院一般資料相仿單獨(dú)行放射治療B期以上宮頸癌患者30例作為對(duì)照組比較。所有的病例均經(jīng)病理檢查確診，按1995年FIGO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期。實(shí)驗(yàn)組：B期16例，期11例，期1例；鱗癌25例，腺癌3例；平均年齡54.2歲；對(duì)照組：B期18例，期11例，期1例；鱗癌26例，腺癌4例；平均年齡53.6歲。兩組資料具可比性，P0.05。    1.2   方   法    1.2.1   疫苗制備    組成：1號(hào)液（細(xì)胞活性檢測(cè)液）1

10、ml，2號(hào)液（處理劑A）1ml，3號(hào)液（處理劑B）2ml，4號(hào)液（細(xì)胞穩(wěn)定劑）5ml，5號(hào)液（防菌劑）5ml，6號(hào)液（檢菌劑）5ml。    所用藥液均按GMP標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)、安全可靠。貯存：4，保存期6個(gè)月；-20，保存期24個(gè)月。    操作步驟：取瘤組織12g，用注射用生理鹽水（以下簡(jiǎn)稱(chēng)生理鹽水）沖洗干凈，剪除癌旁組織。以銳利刀剪切成5mm3碎塊，置于生理鹽水中。用100目鋼網(wǎng)擠濾，收集細(xì)胞懸液。離心(800r/min，10min)，棄上清。生理鹽水洗(每次洗后800r/min，離心10min)2次，稀釋成12ml細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)活瘤細(xì)

11、胞：取滴細(xì)胞懸液和1滴1號(hào)液混勻，放置3min，然后取1滴染色混合細(xì)胞懸液于血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤(pán)內(nèi)，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)未藍(lán)染之瘤細(xì)胞(即活瘤細(xì)胞)。用下式計(jì)算：活瘤細(xì)胞/ml=總數(shù)×2.5×1000(×稀釋倍數(shù))。取 2×108細(xì)胞，加入2號(hào)液1ml，于50%CO2培養(yǎng)箱中37孵育1h。生理鹽水洗(每次洗后800r/min離心10min)2次，稀釋成12ml的懸液。加等量3號(hào)液，輕輕混勻，室溫下置40min。生理鹽水洗2次，每次洗后800r/min，離心10min，棄上清。加等量4號(hào)液，輕輕混勻，室溫下置20min。生理鹽水洗2次(每次洗后 800r/

12、min，離心10min)。取5號(hào)液5ml按（1×1072×107/0.5ml)，稀釋成細(xì)胞懸液，4保存。取6號(hào)液5ml于培養(yǎng)瓶：接種100l瘤苗于瓶中液體，37培養(yǎng)3d，檢測(cè)有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。無(wú)菌檢驗(yàn)合格瘤苗即可等量分裝成48支，每支1ml包裝、備用。    1.2.2   免疫接種     接種前1周給病人靜脈點(diǎn)滴環(huán)磷酰胺400mg進(jìn)行免疫調(diào)動(dòng)。免疫調(diào)動(dòng)1周后開(kāi)始接種，每周1次，共4次為1個(gè)療程。首次免疫(第一療程)選擇患者前臂或肩三角區(qū)(也可在下腹股溝部皮膚)淋巴引流區(qū)域皮膚，進(jìn)行三點(diǎn)

13、注射，每點(diǎn)相距 35cm，皮內(nèi)一點(diǎn)約0.2ml，皮下兩點(diǎn)，每點(diǎn)約0.4ml。首次免疫治療后一個(gè)月，進(jìn)行強(qiáng)化免疫（第二療程），方法同上。    1.2.3   放射治療     免疫接種第一次后，開(kāi)始進(jìn)行放射治療，采用美國(guó)瓦里安公司生產(chǎn)的6MV直線(xiàn)加速器進(jìn)行體外照射，先行全盆對(duì)穿照射，上界在L4L5椎體間，下界達(dá)閉孔下緣，側(cè)界以真骨盆外1cm矩形野照射，劑量DT2530Gy，然后中線(xiàn)擋鉛(前寬4cm，后寬6cm)對(duì)穿照射，DT劑量2025Gy。常規(guī)放療：每次照射2Gy,每周5次，總劑量 DT4555Gy。腔

14、內(nèi)治療：采用192Ir高劑量率后裝治療機(jī)，在完成全盆照射 DT2030Gy后，就開(kāi)始腔內(nèi)放療，腔內(nèi)放療當(dāng)日停外照射1次。腔內(nèi)照射每周1次，每次照射A點(diǎn)劑量6Gy，共計(jì)56次。A點(diǎn)腫瘤量DT3036Gy。治療時(shí)陰道增寬棉球盡量使施源器位于中平面，以減少直腸及膀胱受量。    1.3   觀察指標(biāo)     采用貝科曼公司生產(chǎn)的FACS流式細(xì)胞儀及相應(yīng)單抗檢測(cè)患者在治療前及治療23周后外周血中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+免疫指標(biāo)變化。    放射治療的近期療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)按W

15、HO(1981)標(biāo)準(zhǔn)1，完全緩解(CR)：所有的癥狀、體癥完全消失至少4周;部分緩解(PR)：腫瘤大小約減少50%至少4周。未愈(NC)：無(wú)明顯變化，腫瘤大小減少50% 或出現(xiàn)新病灶。    1.4   統(tǒng)計(jì)學(xué)方法    數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本率的比較采用2檢驗(yàn)，以P<0.05為有顯著性差異。    2   結(jié)   果    2.1   實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組外周血免疫指標(biāo)變化&

16、#160;   由表1可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組治療前后數(shù)值差異有顯著性（P0.05)。提示進(jìn)行NDV?鄄ATV接種后，外周血中CD4+、CD4+/CD8+比值顯著增加，CD8+細(xì)胞數(shù)量降低。可增強(qiáng)患者免疫功能。    由表2可見(jiàn)，治療前后免疫指標(biāo)數(shù)值無(wú)顯著性差異（P0.05)，提示單純放射治療不提高患者免疫功能。    2.2   兩組患者放射治療近期療效及毒副反應(yīng)情況    由表3可見(jiàn)，兩組間放射治療的臨床治愈率差異有顯著性意義(P0.05)，提示放射治療加 NDV?鄄ATV

17、主動(dòng)免疫治療能提高患者臨床近期療效。    實(shí)驗(yàn)組中有2例接種后皮膚出現(xiàn)紅、腫，直徑0.7cm，無(wú)潰瘍形成，無(wú)需特殊處理，均自行消失。兩組放射治療過(guò)程中均有出現(xiàn)輕微里急后重感，經(jīng)思密達(dá)沖劑口服后消失；實(shí)驗(yàn)組中無(wú)1例白細(xì)胞下降，對(duì)照組中有2例白細(xì)胞下降，兩組毒副反應(yīng)差異無(wú)顯著性。NDV?鄄ATV不影響放射治療的進(jìn)行。    3   討   論    新城雞瘟病毒(New castle disease virus，NDV)屬一種禽類(lèi)的副黏液病毒，能選擇性感染腫瘤細(xì)胞，對(duì)

18、人體無(wú)毒無(wú)害。新城雞瘟病毒修飾的自體腫瘤細(xì)胞疫苗，NDV?鄄ATV是以腫瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞，以天然病毒新城雞瘟病毒(NDV)為載體，通過(guò)病毒對(duì)靶細(xì)胞自然感染，達(dá)到人類(lèi)有目的的“轉(zhuǎn)基因”效果。新鮮分離的腫瘤細(xì)胞具有多種潛在的腫瘤相關(guān)抗原，用NDV與其融合制備而成的疫苗，由于NDV病毒含有具有融合活性的融合蛋白F和神經(jīng)氨酸酶HN，通過(guò)其與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，改變了腫瘤細(xì)胞表面形態(tài)，使機(jī)體免疫系統(tǒng)得以識(shí)別。利用新城雞瘟病毒治療腫瘤的主動(dòng)特異性免疫治療，作為有效腫瘤疫苗的生物佐劑，聯(lián)合運(yùn)用疫苗來(lái)表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的特異組分和增加腫瘤細(xì)胞免疫原的非特異組分。新城雞瘟病毒修飾自體腫瘤疫苗的制備采用患者自體的腫瘤組織，

19、經(jīng)過(guò)病毒感染修飾后的腫瘤細(xì)胞，發(fā)生了兩個(gè)方面的轉(zhuǎn)變：一是病毒的感染增強(qiáng)了腫瘤的免疫原性，二是具有直接向T淋巴細(xì)胞呈遞抗原能力2。新城雞瘟病毒是一種有效安全的增殖病毒，它不能在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，所以對(duì)人無(wú)感染性，同時(shí)其攜有腫瘤特異性相關(guān)抗原，能夠被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而引起機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，使患者的免疫系統(tǒng)得以重建。腫瘤的免疫療法是以激發(fā)和增強(qiáng)腫瘤宿主的免疫功能，以達(dá)到控制和殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞主要有誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞(CD4+)和殺傷性T淋巴細(xì)胞(CD8+)。研究發(fā)現(xiàn)，CD4+/CD8+細(xì)胞比值是決定機(jī)體免疫狀態(tài)和免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。一般認(rèn)為，腫瘤患者由于細(xì)胞免疫功能受到損害，體內(nèi)的

20、CD4+細(xì)胞減少，同時(shí)CD8+增多，而且隨著病情的進(jìn)展，其外周血中CD4+/CD8+降低，甚至倒置。在接受新城雞瘟病毒修飾的自體腫瘤疫苗主動(dòng)特異性免疫療法后，總T淋巴細(xì)胞CD4+增加，CD8+降低，CD4+/CD8+細(xì)胞比值恢復(fù)正常，表明患者自身細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能得以恢復(fù)和提高3，也表明患者免疫功能有所增強(qiáng)。      本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)放射治療+NDV?鄄ATV組與單獨(dú)放射治療組比較，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組治療后CD4+、CD4+/CD8+數(shù)值升高，CD8+數(shù)值降低，而對(duì)照組無(wú)明顯變化，表明NDV?鄄ATV能提高和恢復(fù)患者的細(xì)胞免疫功能，對(duì)放射治療有協(xié)同性，使放

21、射治療的近期療效明顯提高，并且毒副反應(yīng)輕，不影響放射治療的進(jìn)行，是一種安全的輔助治療手段，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致4。隨著腫瘤生物治療技術(shù)的發(fā)展，該方法將更加完善，最終造福于廣大癌癥患者。    【參考文獻(xiàn)】  1    孫燕. 臨床腫瘤內(nèi)科手冊(cè)M. 第4版.北京：人民衛(wèi)生出版社, 2003. 106.    2    Kirchner HH,Anton P, Atzpodien J. Adjuvant treatment of locally advanced renal cancer with autologous virus modified tumor vaccinesJ. World Urol, 1995, 13(3):171.    3    鄺國(guó)乾, 張奕敬, 丘惠芬, 等. 新城雞瘟病毒疫苗免疫治療45例腫瘤患者的近期毒副反應(yīng)J. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1998, 15（1）：111.    4