改良分子信標實時PCR快速檢測大腸桿菌O 157 H 7

1、改良分子信標實時PCR快速檢測大腸桿菌O 157 :H 7    腸出血性大腸桿菌（Enteronbsp;Hemorrhagicnbsp;E.coli）Onbsp;157nbsp;:Hnbsp;7nbsp;是近十年來認識的一種引起人類出血性結(jié)腸炎（Hemorrhagicnbsp;coli-tisnbsp;HC）和溶血性尿毒綜     賀連華 ，扈慶華 ，石曉路 ，鄭琳琳 ，李慶閣 ，張佳峰 ，莊志雄 ，劉小立 ，張順祥 ，王冰 ，吳平芳 ，劉濤 摘要:目的 建立改良分子信標實時PCR快速檢測大腸桿菌O 157 :H

2、 7 的快速方法。 方法 根據(jù)GenBank公布O 157 :H 7 的rfbE保守序列，設計一對引物和改良分子信標探針，用FAM熒光劑標記探針的5'端，建立改良分子信標實時PCR檢測O 157 :H 7 的反應體系，應用于食物中毒快速診斷和食品微生物檢測。 結(jié)果 共檢測11種細菌，只有大腸桿菌O 157 :H 7 有熒光信號，其余10種全無熒光信號，且與其他細菌無交叉反應，DNA靈敏度為64fg，菌液靈敏度為59cfu/ml或2cfu/PCR反應體系。應用改良分子信標實時PCR反應體系檢測10株O 157 :H 7 均出現(xiàn)特異的熒光信號，無干擾。對89份食品樣品進行檢測，5份O 15

3、7 :H 7 實時PCR陽性，其余樣品為陰性，檢測僅需2h。5份陽性樣本，經(jīng)傳統(tǒng)方法培養(yǎng)，有3份檢出大腸桿菌O 157 :H 7 。 結(jié)論 改良分子信標實時PCR檢測體系快速、靈敏度高，特異性強，可用于大腸桿菌O 157 :H 7 食物中毒的快速診斷和食品微生物檢測，為食源性疾病的分子流行病學調(diào)查提供新的檢測手段。   關(guān)鍵詞:大腸桿菌O 157 :H 7 ;改良分子信標;實時PCR   Rapid Detection of E.coli O 157 :H 7 by using modified beacons and real-time PCR.   HE Li

4、an-hua，HUQing-hua，SHI Xiao-lu，et al.   （Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China）     Abstract:Objective To establish a method for rapid detection of E.coli O 157 :H 7 from samples of contaminated food by using modified molec

5、ular beacons and real-time PCR. Methods The primers and modified molecular beacons were designed based on the core sequence of rfbE gene published on GenBank for detection of E.coli O 157 :H 7 .The probe was labeled with FAM at5'end.The molecular beacons and primer setwas tested against numerous

6、 strains from11different bacterial species and used for rapid detec-tion and diagnosis of ffod poisoning. Results For the modified molecular beacons-based real-time PCR assay，the sensitivity was64fg，59cfu/ml or2cfu/PCR reaction.There was no cross-reaction with other bacteria as control.The real-time

7、 PCR assay was used to detect10E.coli O 157 :H 7 and no false signals were observed.89food samples were tested and E.coli O 157 :H 7 was de-tected from5samples by real time PCR.3samples were positive for E.coli O 157 :H 7 detected by traditional culture method.The overall test could be finished with

8、in2hours. Conclusion The modified molecular beacons-based real-time PCR assay is rapid，sensitive and specific for detection of E.coli O 157 :H 7 from contaminated food.   Key words:E.coli O 157 :H 7 ;Modified molecular beacon;Real-time PCR        腸出血性大腸桿菌（Entero He

9、morrhagic E.coli）O 157 :H 7 是近十年來認識的一種引起人類出血性結(jié)腸炎（Hemorrhagic coli-tis HC）和溶血性尿毒綜合怔（Hemolytic aremic syndrom HUS）的腸道致病菌 1 。由于E.O 157 :H 7 感染劑量極低，在食入不足5個細菌就可引起疾病，且病情發(fā)展快，死亡率高，近年在歐美、日本等國已多次爆發(fā)流行，對人類的健康構(gòu)成了重大的威脅 2 。我國1986年已發(fā)現(xiàn)E.O 157 :H 7 感染病人，并在安徽、江蘇等地爆發(fā)了食物中毒 3 。O 157 :H 7 也可以感染動物，并在實驗動物中引起類似于出血性腸炎或溶血性尿毒綜合

10、怔等癥狀，表明是一種人畜共患病 4 。     我國目前對E.O 157 :H 7 等病原體大多數(shù)是傳統(tǒng)的細菌學檢測，細菌從分離、培養(yǎng)、鑒定需要1周左右的時間，耗時耗材，而且檢出率很低，顯然對E.O 157 :H 7 等惡性病原體爆發(fā)的診斷不適宜 5 。自1995年美國PE公司提出實時PCR檢測原理后，實時PCR以其快速、定量、無需后電泳、無交叉污染等突出優(yōu)點而被廣泛采用 6 。其原理為退火階段，分子信標與生產(chǎn)的靶序列結(jié)合發(fā)出熒光，在延伸階段則脫離靶序列而不干擾擴增，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，與摸板結(jié)合的分子信標的量亦增加，最終的熒光強度與模板量成正相關(guān)。改良分子信標是

11、在分子信標的基礎(chǔ)上提出的一種新型分子探針，以它為基礎(chǔ)建立的實時PCR技術(shù)可以更好地實現(xiàn)實時PCR檢測多種致病菌。本文采用改良分子信標技術(shù)建立E.O 157 :H 7 的實時PCR方法，和國家標準方法比較，顯示新方法的準確性和靈敏度，并用于食物中毒快速診斷和食品致病菌篩查。與常規(guī)PCR方法相比，由于引物和探針的“雙保險”，顯示特異性更強，并具有操作簡單、可定量、污染少等優(yōu)點。   1 材料與方法     1.1 實驗菌株 包括1株沙門氏菌、1株志賀氏菌、1株EPEC、1株EIEC、1株ETEC、1株O 157 :H 7 、1株金黃色葡萄球菌、1株蠟樣芽孢桿

12、菌、1株李斯特菌、1株變形桿菌、1株副溶血性弧菌，全部菌株均購自中國藥品生物制品檢定所。     1.2 模板提取 全部菌株經(jīng)LB增菌培養(yǎng)過夜后，菌體用500l TEbuffer懸浮，加入終濃度為1%SDS和0.2g/l的蛋白酶K，55作用1h后，用酚-氯仿抽提DNA?；蛉?ml菌液，離心沉淀，制備菌懸液，煮沸，取上清夜5l用于實時PCR反應。   1.3 引物和探針設計 根據(jù)GenBank公布的O 157 :H 7 rfbE的序列并比較分析，自行設計一對引物和探針，引物和探針均由上海Sangon公司合成，探針用FAM標記。   &#

13、160; 1.4 PCR反應條件 反應總體積為25l，內(nèi)含5l模板，2.5l110PCR緩沖液，1.5mmoMgc12，0.25mmol/Ld-NTP，IUTaq酶，25pmol引物，25pmol探針。實時PCR反應參數(shù)為94預變性5min，40個循環(huán)中94變性30s，52退火40s，72延伸30s。用icycle熒光PCR擴增儀（Bio-Rad）檢測退火的熒光。     1.5 結(jié)果判斷 檢測樣本Ct值小于等于35.0時，測定結(jié)果有效，可直接報告樣本陽性;檢測樣本Ct值大于35.0且小于40時，重復一次，如果Ct值仍小于40，且曲線有明顯的對數(shù)增長期，可報告樣本

14、陽性，否則報告樣本陰性;檢測不到樣本Ct值時，報告樣本陰性。     1.6 特異性檢測 用上述11種細菌作對照，對O 157 :H 7 進行rfbE改良分子信標實時PCR擴增。取O 157 :H 7 作為代表株，包括DNA靈敏度分析和菌液靈敏度分析。DNA靈敏度分析為按常規(guī)DNA提取方法提取模板DNA用Ultrospec2000紫外可見光核酸分析儀（Phamacia公司）測DNA的濃度。然后進行5倍稀釋，每個稀釋度取1ul用于實時PCR反應。菌液靈敏度分析為O 157 :H 7 增菌后，進行10倍稀釋，工作10個稀釋度，然后依次取10個稀釋度的1ml菌液進行實時

15、PCR反應。   2 結(jié)果     2.1 特異性分析 11種細菌經(jīng)改良分子信標體系檢測，只有O 157 :H 7 有熒光信號其他細菌無熒光信號，DNA靈敏度為64fg/l，菌液靈敏度為59cfu/ml或2cfu/PCR反應體系。     2.2 樣本檢測結(jié)果 對89份樣本以改良分子信標實時PCR快速檢測結(jié)果見表1。     表1 89份樣本以改良分子信標實時PCR O 157 :H 7 的檢出情況（略）     對其中5份PCR法檢出O 157 :H 7 陽性的樣

16、本，用金標法篩選，顯示均為強陽性;用傳統(tǒng)培養(yǎng)法，檢測檢出3份。     3 討論     本文在改良分子信標技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了實時PCR快 速檢測O 157 :H 7 的方法。結(jié)果表明此方法檢測DNA靈敏度為64fg/ul，菌液靈敏度為59cfu/ml或2cfu/PCR反應體系，以及特異性強，與對照組11種細菌無交叉反應，且操作簡單，結(jié)果觀察直觀明了，可一次檢測96份樣品，適用于O 157 :H 7 食物中毒的快速診斷和大量樣品的檢測，無交叉污染。對于大便和嘔吐物標本，從樣品處理到檢測結(jié)果僅需2h，對食品樣本僅需1d時間。在建立單一

17、實時PCR快速檢測細菌的基礎(chǔ)上，最終實現(xiàn)多重實時PCR同時診斷10種食源性致病菌，滿足常見細菌性食物中毒快速診斷的要求。     改良分子信標探針是為了提高雜交效率，在原來分子信標的基礎(chǔ)上提出來的。改良分子信標的突出特點是將分子信標的臂部分也作為靶識別序列，而不僅僅是用于形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的無關(guān)添加序列。對于同樣長度的檢測靶序列，改良分子信標比分子信標更短，而且由于臂序列不再懸空，因而與靶序列的結(jié)合更緊密。改良分子信標比分子信標更易設計且成功率更高，同時對擴增條件要求不嚴。     本文所建立的實時PCR技術(shù)快速檢測方法，可用于細菌性食物中

18、毒和食品微生物的檢驗，隨著生態(tài)環(huán)境的變化和抗生素的濫用，許多致病菌引起的臨床癥狀越來越不典型，常常需要同時檢測多種細菌才能確定病原。另外在食品微生物檢驗中，如果只采用單一分子信標體系檢測單一細菌，就會出現(xiàn)成本高的缺點。因此，又快又能同時檢測多種病原微生物的多重實時PCR技術(shù)檢測多種細菌是未來發(fā)展方向。   參考文獻:      1 Griffin PM andRV Tauxe.The epidemiology of infections caused by Es-chrichia Coli O157 :H 7 ，other enterohemorrhagic E.coli，and the associated hemolytic uremic syndromeJ.Epidemiol Rev，1991，13（1）:6098.     2Ony J，Zhe-L，Robins-Browne-R，et al.Prevalence of verocytotoxigenic Eshcherichia coli serotype O154 :H 7 in children with diarrhoea attendinga