干擾素-γ 874位點(diǎn)基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的關(guān)系

1、干擾素-+874位點(diǎn)基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的關(guān)系         11-01-16 16:05:00     作者：劉佳韓麗莎    編輯：studa20【摘要】  目的：研究IFN-+874位點(diǎn)基因多態(tài)性在內(nèi)蒙古地區(qū)漢族人群慢性阻塞性肺病(COPD)患者中的頻率分布,并分析其與COPD發(fā)病的相互關(guān)系。方法：采用病例對(duì)照研究方法進(jìn)行相關(guān)資料的問卷調(diào)查，PCR-SSP法檢測(cè)IFN-+874位點(diǎn)在病例組與對(duì)照組中的各種基因型

2、頻率與等位基因頻率。結(jié)果：COPD組IFN-+874位點(diǎn)AA、AT、TT基因型的頻率分別為82.8 %、17.2 %和0.0%;對(duì)照組AA、AT、TT基因型的頻率分別為63.4 %、33.3 %、3.1 %;COPD組IFN-位點(diǎn)+874位點(diǎn)A、T等位基因頻率分別為91.4 %、8.6 %，對(duì)照組中為80.3 %、19.7 %;COPD組IFN-+874位點(diǎn)AA基因型頻率及A等位基因頻率均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：IFN-+874位點(diǎn)基因多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)漢族人群COPD的發(fā)病有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  慢性阻塞性肺疾病;干擾素-;基因多態(tài)性Abstract

3、Objective: To explore the frequency distribution of genetic polymorphism of interferon-+874(IFN-+874) in the patients with chronic obstructive pulmonary diseases(COPD) among Han nationality in Inner Mongolia and to analyze the correlation between genetic polymorphism of IFN-+874 and the incidence of

4、 COPD. Methods: The case-control method was employed to carry out a questionnaire investigation of the related data and genotype and allele frequency of IFN-+874 in the COPD group and the control group was determined with PCR-SSP. Results: The genotype frequency of IFN-+874 AA, AT and TT was 82.8 %,

5、 17.2 % and 0.0 %, respectively, in COPD group and that in the control group was 63.4 %, 33.3 % and 3.1 %, respectively. Allele frequency of IFN-+874A and T was 91.4 % and 8.6 % in COPD group, and that in the control group was 80.3 % and 19.7 %. Genotype frequency of IFN-+874AA and allele frequency

6、of IFN-+874A in COPD were both higher than those in the control group(P<0.05). Conclusion: Genetic polymorphism of IFN-+874 is correlated to the incidence of COPD among the population of Han nationality in Inner Mongolia.Key wordsCOPD; The interferon gamma; Polymorphism genetics慢性阻塞性肺病(Chronic Ob

7、structive pulmonary disease,COPD)是常見的呼吸系統(tǒng)疾病，以慢性氣流阻塞、進(jìn)行性發(fā)展為特征，嚴(yán)重危害人類健康，降低生活質(zhì)量。發(fā)病與環(huán)境和遺傳因素有關(guān)，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。干擾素gamma(IFN-)第一內(nèi)含子區(qū)+874位點(diǎn)A/T單核苷酸多態(tài)性影響轉(zhuǎn)錄及IFN-的表達(dá)量1-2。而IFN-+874位點(diǎn)基因多態(tài)性是否與COPD發(fā)病有關(guān)，到目前為止尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用病例對(duì)照方法分析探討IFN-基因多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)COPD患者發(fā)病的關(guān)系，為深入研究COPD的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1研究對(duì)象COPD組64例，按照2003年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)

8、分會(huì)COPD診療指南3綜合分析確定，病例由包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院、包頭市中心醫(yī)院、鄂爾多斯市中心醫(yī)院提供。對(duì)照組66例為健康體檢者，未患呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病，由包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。COPD組與對(duì)照組靜脈采血2.0 mL，以枸櫞酸鈉抗凝，-20 冰箱中保存。研究對(duì)象的一般資料見表1。表1研究對(duì)象的一般情況計(jì)量資料以x±s表示，F(xiàn)EV1:第一秒用力呼氣容積，F(xiàn)VC:用力呼氣肺活量1.2試劑與儀器試劑購自北京鼎國生物工程公司，引物由上海生工生物工程公司合成。PCR儀(The Perkin-Elmer Corporation PE480),紫外透射反射分析

9、儀(上?？岛坦怆妰x器有限公司)，DYCZ-24D型垂直電泳槽(北京六一儀器廠)。1.3方法1.3.1DNA提取枸櫞酸鈉抗凝的凍存血，室溫放置自然融化后取50 L到1.5 mL的EP管中，加雙蒸水至1 mL，混勻，室溫靜置15 min后3 000 rmp離心1 min，棄上清留殘液;向1.5 mL的EP管中加裂解液60 L，震蕩器上劇烈震蕩100 s;沸水煮10 min，流水冷卻約50 s，振蕩器再次劇烈震蕩約100 s;11 500 rmp高速離心4 min，上清液中含有模板DNA。1.3.2引物上海生工生物工程公司合成。正向引物P1序列：5'-TTCTTACAACACAAAATCAA

10、ATCA-3'，正向引物P2序列：5'-TTCTTACAACACAAAATCAAATCT-3'，外參正向引物P3序列：5'-GCCTTCCAACCATTCCCTTA-3'，反向引物p4序列：5'-TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3'。1.3.3PCR及IFN-+874 SNP鑒定聯(lián)合聚合酶鏈反應(yīng)順序特異性引物法(PCR-SSP)對(duì)IFN-的基因進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣本設(shè)立3個(gè)反應(yīng)管，分別加有特異引物P1、P2、P3。PCR反應(yīng)體系：總反應(yīng)體積為12.5 L，包括：10×PCR buffer 1.25 L，4×d

11、NTP 0.25 L，DNA模板2 L，Taq DNA聚和酶(2 U/L)0.5 L，上下游引物各0.1 L,滅菌雙蒸水加至12.5 L。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ，2 min;變性94 ，25 s;退火60 ，35 s;延伸72 ，45 s;10個(gè)循環(huán)后，變性94 ，25 s;退火56 ，35 s;延伸72 ，45 s;20個(gè)循環(huán)，總延伸72 ，5 min。每次檢測(cè)至少設(shè)置2個(gè)空白對(duì)照，PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。1.3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 15.0建立數(shù)據(jù)庫，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。     11-01-16

12、 16:05:00     作者：劉佳韓麗莎    編輯：studa202結(jié)果2.1PCR擴(kuò)增特異引物P1擴(kuò)增出的IFN-基因AA產(chǎn)物和P2擴(kuò)增出的IFN-基因AT產(chǎn)物均為261 bp,內(nèi)參引物P4擴(kuò)增產(chǎn)物為426 bp，每例樣本有3管擴(kuò)增產(chǎn)物，即A、T、外參，見圖1。圖1IFN-+874位點(diǎn)基因PCR擴(kuò)增第1、4、8泳道為T;第2、5、9泳道為A;第3、6、10泳道為外參，第7泳道為Marker。樣本1為AT雜合子(1、2、3泳道)，樣本2為TT純和子(4、5、6泳道)，樣本3為AA純和子(8、9、10泳道)。2

13、.2IFN-+874基因型頻率及等位基因頻率的比較COPD組IFN-+874位點(diǎn)AA、AT、TT基因型的頻率分別為82.8 %、17.2 %和0.0 %，正常對(duì)照組AA、AT、TT基因型的頻率分別為63.6 %、33.3 %、3.1 %，COPD組AA基因型頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=6.073，P=0.013);COPD組IFN-+874位點(diǎn)A、T等位基因頻率分別為91.4 %、8.6 %，對(duì)照組中為80.3 %、19.7 %，COPD組A等位基因頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=5.356,P=0.021)。見表2。表2COPD組與對(duì)照組中IFN-基因型頻率與等位基因頻率比較

14、3討論COPD發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，而以細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞為主的氣道壁及肺泡隔的慢性炎癥和進(jìn)行性發(fā)展的氣道阻塞是COPD發(fā)病的兩大特點(diǎn)4-5。由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-有可能是連接COPD發(fā)病機(jī)制中細(xì)胞分子生物學(xué)和蛋白酶/抗蛋白酶系統(tǒng)失衡的橋梁6。IFN-為一種低分子量的糖蛋白，是細(xì)胞因子的重要組成之一，產(chǎn)生于CD4+TH1和CD8+TC1細(xì)胞，可激活中性粒細(xì)胞，發(fā)生呼吸爆發(fā);也可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附及血管外滲出，參與人體炎癥和免疫反應(yīng)，是COPD發(fā)病過程中的重要細(xì)胞因子。IFN-的合成為遺傳基因所控制，IFN基因位于染色體12

15、q13-q24。位于基因表達(dá)調(diào)控區(qū)序列的基因SNP在疾病的個(gè)體差異方面有重要意義。IFN-+874位點(diǎn)正好位于轉(zhuǎn)錄因子NF-B的結(jié)合位點(diǎn)，此處出現(xiàn)SNP直接影響與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，從而影響IFN-的表達(dá)7，TT為高表達(dá)基因型,AA為低表達(dá)基型,AT為中等表達(dá)基因型。IFN-在成年鼠肺中的表達(dá)能導(dǎo)致許多方面類似人類COPD損害的表現(xiàn)8，由此可以推想，人類IFN-基因多態(tài)性可能與其COPD的患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)9。為明確IFN-基因多態(tài)性與COPD的發(fā)病的關(guān)系是否相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)COPD患者IFN-基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)分析，研究結(jié)果顯示IFN-+874位點(diǎn)AA基因型頻率在COPD組高于對(duì)照組，A等

16、位基因型頻率在COPD組亦高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IFN-+874位點(diǎn)基因多態(tài)性與COPD的發(fā)病有關(guān)，攜帶AA基因的個(gè)體患COPD的危險(xiǎn)性增加，其機(jī)制可能是由于干擾素-主要活性就是參與免疫調(diào)節(jié),在體內(nèi)起雙向調(diào)節(jié)作用：一方面,干擾素-可激活NK等細(xì)胞,參與炎癥反應(yīng);另一方面,它能抑制B細(xì)胞分泌IgE,抑制超敏反應(yīng)的發(fā)生。攜帶AA基因的個(gè)體干擾素-的合成或分泌不足，機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力降低，炎癥與抗炎作用失衡，導(dǎo)致了COPD的發(fā)生、發(fā)展。然而COPD是一種多因素參與的疾病，其中環(huán)境因素和遺傳因素均起著重要作用，其作用的具體機(jī)制仍有待深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Billiau A

17、,Heremans H,Vermeire K,et al.Immunomodulatory properties of interferon-gamma.An updateJ.Ann N Y Acad Sci,1998,856:22-32.2Pravica V, Asderakis A, Perrey C,et al.In vitro production of IFN-gamma correlations with CA repeat polymorphism in the human IFN-gammaJ.Eur J Immunogenet,1999,26(1):1-3.3中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病

18、學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南J.中華結(jié)核和呼吸雜志,2002,25(8):453-460.4López-Maderuelo D,Arnalich F,Serantes R,et al.Interferon-gamma and Interleukin-10 gene polymorphisms in pulmonary tuberculosisJ.Am J Respir Crit Care Med,2003,167(7):970-975.5Jeffery PK.Lymphocytes,chronic bronchitis and chronic obstructive pulmo