幾種基因操作的工具酶

1、一、限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)當(dāng) 心）噬菌體侵染E.coliB 時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列， 被降解掉。而E.coliB 的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下,催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。Eco核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。最早分離出的限制內(nèi)切酶是在1968年，Meselson和Yuan,大腸桿菌B和K菌株，EcoB和EcoK，是I型的，沒有實(shí)用價(jià)值。首個(gè) II 型限制內(nèi)切酶是在 1970年,由 等從 Heamophilus influenzae 的 Rd菌株中H

2、ind II 。使得DNA分子的體外精確切割成為可能。從此，相關(guān)研究展開。如NEB公司的提取和克隆。目前已純化出 3000種限制性內(nèi)切酶中，其中有30%是在NEB發(fā)現(xiàn)的。限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endon uclease ）:是一類能夠識(shí)別雙鏈 DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。切開的是 3，5-磷酸二 酯鍵。（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類分為 I 型、 II 型和 III 型。（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名1、 寄主菌屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)斜體字母的略語表示酶來源的菌種名稱,如大腸桿菌 Escherichia coli

3、 表示為 Eco , 流 感嗜血菌 Haemophilus influenzae 表示為 Hin;2、 用一個(gè)正體字母表示菌株的類型,比如EcoR、Hind;3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個(gè)不同的限制修飾體系,則用羅馬數(shù)字標(biāo)出,比如 Eco R I 、 Hin 。 d III（四）II 型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性1、識(shí)別位點(diǎn)的特異性每種酶都有其特定的 DNA識(shí)別位點(diǎn)，通常是由 48個(gè)核苷酸組成的特定序列（靶序 列）。2、識(shí)別序列的對(duì)稱性靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。3、切割位點(diǎn)的規(guī)范性交錯(cuò)切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。與 II 型核酸內(nèi)

4、切酶有關(guān)的幾個(gè)概念粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的 單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新環(huán)化起來。平末端：Blunt end 在識(shí)別序列對(duì)稱處同時(shí)切開DNA分子兩條鏈，產(chǎn)生的平齊末端結(jié)構(gòu)。則不易于重新環(huán)化。同裂酶： isoschizomers 能識(shí)別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來源的內(nèi)切酶。不 同同裂酶對(duì)位點(diǎn)的甲基化敏感性有差別。同尾酶： isocaudamers 識(shí)別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。如 BamH I 、BclI 、BglII 和 Xho I 是一組同尾酶。注 意： 由同尾酶產(chǎn)生

5、的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的 粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識(shí)別。（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)一個(gè)限制酶單位（U）指：在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為37C ）下， 1h 內(nèi)中完全降解 1 mg l DNA 所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有： DNA的純度 DNA 的甲基化程度 酶切反應(yīng)的溫度（通常為37 C ） DNA的分子結(jié)構(gòu) 核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液在“非最適的 ”反應(yīng)條件下 , 有些核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別序列的特異性便會(huì)發(fā)生 “松動(dòng)”，從 其正確”識(shí)別序列以外的其它位點(diǎn)切割DNA分子，這種現(xiàn)象叫星號(hào)活性。用*

6、表示。二、DNA連接酶及其應(yīng)用（一 ）DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)環(huán)形DNA分子的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家相信一定有一種能連接這種切口的酶存在。首個(gè)DNA連接酶（ligase）大腸桿菌DNA1接酶，是1967年發(fā)現(xiàn)的，是大腸桿菌 基因編碼。1970年，發(fā)現(xiàn)了 T4DNA連接酶，由大腸桿菌 T4噬菌體基因編碼的。（二）DNA連接酶作用特點(diǎn)1. 連接的兩條鏈必須分別具有自由3 -OH和5 -P，而且這兩個(gè)基團(tuán)彼此相鄰；2. 在羥基和磷酸基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程。E.coli DNA 連接酶 - 連接具互補(bǔ)堿基黏性末端 （最初研究表明 ） ，現(xiàn)在研究可連接平末 端;需NAD+甫助因子，活性低，不常用。T 4DN

7、A連接酶-連接具互補(bǔ)堿基黏性末端和平末端，需ATP輔助因子，活性高，常用。（三）DNA連接酶的反應(yīng)條件影響連接效率的因素有：1. 溫度（通常在4-15 C ）2. ATP 的濃度（10 兇/L - 1mM/L ）3. 連接酶濃度（一般平末端大約需12U,黏性末端僅需 0.1U）4. 反應(yīng)時(shí)間 （ 通常連接過夜 ）5. 插入片段和載體片段的摩爾比 （1 : 15 : 1）（四）T4 DNA連接酶對(duì)目的DNA片段和載體連接的一般方案1. 連接反應(yīng)一般在滅菌的 0.5ml 離心管中進(jìn)行。2.10 M體積反應(yīng)體系中：取載體 50-100ng，加入一定比例的外源 DNA分子（一般線 性載體DNA分子與外

8、源 DNA分子摩爾數(shù)為1 : 15 : 1），補(bǔ)足ddH20至8 pl。3. 輕輕混勻，稍加離心，56C水浴5min后，迅速轉(zhuǎn)入冰浴。4. 加入含ATP的10XBuffer 1 p , T4 DNA連接酶合適單位，用ddH2O補(bǔ)至10 p，稍加離心，在適當(dāng)溫度（一般14-16 C ）連接8-14hr。三、DNA聚合酶及其應(yīng)用（一）大腸桿菌DNA聚合酶I是 Kornberg A. 1956 年首先從大腸桿菌 E。 Coli 細(xì)胞中分離出來的。它是一種多功 能性的酶，包括 3 種不同的酶活力：5'-3聚合酶活性（模板，帶3-OH游離基團(tuán)的引物、4dNTPs Mg2+ ）。雙鏈特異性的5&#

9、39; f 3核酸外切酶活性。3' f 5'核酸外切酶活性。從游離的雙鏈或單鏈 DNA的3端降解。不過對(duì)于雙鏈的降解可被5-3的多聚活性所抑制。主要是校正作用。大腸桿菌DNA聚合酶I的三種用途1. 利用缺口轉(zhuǎn)移法制備高比活度的DNA探針利用其5 -3的外切酶活性及其聚合酶活性。2. 用于DNA連接前的大缺口填充利用 5 -3 的聚合酶活性。3. 用于DNA的序列分析利用 5 -3 的聚合酶活性。（二 ）Klenow 片段酶Klenow 片段是大腸桿菌聚合酶 I 全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子， 分子量為 76KD 。酶催活性：5' f 3'的聚合酶

10、活性3' f 5'的核酸外切酶活性Klenow片段的主要用途（利用5' f 3'的聚合酶活性）：修補(bǔ)限制性酶消化 DNA形成的3隱蔽末端標(biāo)記DNA片段的末端底物用a-32P-dNTPscDNA克隆中第二鏈cDNA的合成DNA序列的測(cè)定（三）T4 DNA聚合酶T4DNA聚合酶是從T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，1.酶催活性：5 f3 的聚合酶活性3 '蘆 的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶I的活性高200倍。比Klenow 片段酶強(qiáng)1001,000倍。因此，可以綜合利用這兩種活性進(jìn)行取代合成反應(yīng)：如果反應(yīng)體系中僅存在一種 dNTP或沒

11、有底物時(shí)，這時(shí) T4DNA聚合酶就會(huì)表現(xiàn)出 3 5夕卜切酶活力，從雙鏈 DNA的 3開始降解，直到露出底物 dNTP相同的堿基。然后就在此 位置發(fā)生合成和取代反應(yīng)。2. T4DNA聚合酶的用途(1) 利用取代合成反應(yīng)制備探針(2) 標(biāo)記具有平末端的或具有 3'隱蔽末端的DNA片段利用較強(qiáng)的3 ' -5外切酶活性和5 '專聚合活性(3) 用于DNA序列分析(四)逆轉(zhuǎn)錄酶 (反轉(zhuǎn)錄酶 )逆轉(zhuǎn)錄酶是一種依賴RNA的 DNA聚合酶。此酶首先是 1970 年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。這兩個(gè)課題組的論文都 發(fā)在了同一期的 Nature 雜志上。最普遍使用的是從鳥類骨髓母細(xì)

12、胞瘤病毒(AMV)分離出來的?；钚裕阂环N可以有效地將mRN仮轉(zhuǎn)錄成 DNA的酶，其產(chǎn)物稱為 cDNA(complementaryDNA).主要用途是將mRNA專錄成cDNA以制備基因片段。四、修飾性工具酶(一)末端轉(zhuǎn)移酶 (terminal transferase)l末端轉(zhuǎn)移酶是一類不依賴于DNA模板的DNA聚合酶。l特性：該類酶可以在沒有模板鏈存在的情況下，將核苷酸連接到dsDNA或 ssDNA的在3'-0耳特別是對(duì)于平末端的雙鏈DNA末端加尾十分有用。l最常見的用途：給外源DNA片段及載體分子加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以創(chuàng)造黏性末端，便于重組。( 二 ) SI 核酸酶 (SI nuclease)這是一種從米曲霉 (Aspergillus oryzae) 中分離的高度單鏈特異的外切酶?；钚裕嚎梢越到鈫捂?DNA或 RNA或雙鏈的單鏈區(qū)。其主要用途有： 在cDNA合成過程中，切開 cDNA的發(fā)夾末端； 載體構(gòu)建過程中，切去DNA片段的單鏈尾巴，形成平末端結(jié)構(gòu)。(三 ) 堿性磷酸酶 從大腸桿菌中分離的細(xì)菌堿性磷酸酶 (Bacterial Alkaline Phosphatase)簡稱 BAP。從小牛腸中分離的叫小牛腸堿性磷酸酶( Calf