環(huán)孢菌素A兩種不同產(chǎn)生菌原生質體的制備和再生(1)

1、    環(huán)孢菌素A兩種不同產(chǎn)生菌原生質體的制備和再生(1)    】 以環(huán)孢菌素A兩種不同產(chǎn)生菌雪白白僵菌和茄病鐮刀菌為出發(fā)菌株，開展了原生質體制備和再生條件的研究，并分別實現(xiàn)了兩個不同種的菌株原生質體再生。 【關鍵詞】 環(huán)孢菌素A 雪白白僵菌 茄病鐮刀菌 原生質體    Formation and regeneration of protoplasts from two    ABSTRACT Protocols for format

2、ion and regeneration protoplasts for two different fungus species, Beauveria nivea and Fusarium solani, were described. High yield of protoplasts was obtained by using a combined enzyme system containing lywallzyme and snailase. The effects of factors such as osmotic stabilizers, cultivation time, t

3、emperature, pH, incubation time on the formation and regeneration were studied.    KEY WORDS Cyclosporin A; Beauveria nivea; Fusarium solani; Protoplast    環(huán)孢菌素A(cyclosporin A)是由11個氨基酸組成的環(huán)肽，已作為高效免疫抑制劑在人體器官移植上廣泛應用1。1976年瑞士Sandoz公司首次報道了由半知菌屬多孔木霉(Tolypocladium in

4、flatum)后更名為雪白白僵菌Beauvcria nivea)和光澤柱孢菌(Cylindrocarpon lucidum)產(chǎn)生的環(huán)孢菌素A2。此后各國的科學家又陸續(xù)報道了由13種其他產(chǎn)生菌，如茄病鐮刀菌(Fusarium solani)和侵菅新赤殼菌(Neocosmospora varinfecta)等產(chǎn)生環(huán)孢菌素A。福建省微生物研究所于1983年首次報道了從我國土壤中篩選到環(huán)孢菌素A的產(chǎn)生菌茄病鐮刀菌411，在國內(nèi)率先研制成功環(huán)孢菌素A3，4。根據(jù)Ains worth的真菌分類法，茄病鐮刀菌和國際上常用的環(huán)孢菌素A產(chǎn)生菌雪白白僵菌分別屬于絲孢綱(Hyphomycetes)的絲孢目(Hyph

5、omycetales)和瘤座孢目(Tuberculariales)。這兩種產(chǎn)生菌不但在形態(tài)、培養(yǎng)特征和生理特性上有所不同， 而且在工業(yè)化生產(chǎn)工藝和結果各有不同的特點。茄病鐮刀菌生產(chǎn)環(huán)孢菌素A具有發(fā)酵培養(yǎng)基成本低，發(fā)酵周期短(5d)的優(yōu)點，但環(huán)孢菌素A效價和組分含量偏低；雪白白僵菌生產(chǎn)環(huán)孢菌素A具有環(huán)孢菌素A效價和組分含量較高的優(yōu)點，但發(fā)酵培養(yǎng)基成本高，發(fā)酵周期長(1015d)。Kim等5利用雪白白僵菌進行種內(nèi)融合，所獲得的依賴LVal和LLeu的融合株環(huán)孢菌素A效價高達8920 mg/L，但發(fā)酵所需的培養(yǎng)基價格昂貴，使用培養(yǎng)基中氨基酸含量高達36g/L，發(fā)酵周期長達1013d。我們設想將兩種不

6、同的環(huán)孢菌素A產(chǎn)生菌的菌種進行目間原生質體融合，試圖篩選出集合兩個不同菌種優(yōu)點的融合子應用于生產(chǎn)，獲得提高環(huán)孢菌素A生產(chǎn)能力和經(jīng)濟效益的新菌株。本文報道以雪白白僵菌和茄病鐮刀菌為出發(fā)菌株，分別進行原生質體制備與再生條件的研究。    1 材料和方法    1.1 菌種    茄病鐮刀菌S421502和雪白白僵菌X44150均由福建省微生物研究所提供。    1.2 培養(yǎng)基    PDA液體培養(yǎng)基

7、稱取20g去皮土豆，切成小塊狀，加適量水煮30min。用4層紗布過濾，棄去濾渣，于濾液中加入2g葡萄糖，定容到100ml。    PDA斜面瓊脂培養(yǎng)基 100ml PDA液體培養(yǎng)基加瓊脂2g進行制備。    PDA再生培養(yǎng)基 PDA液體培養(yǎng)基，酵母浸汁(膏狀)0.3g，KCl 3.9g，瓊脂2g，定容至100ml。    1.3 試劑    纖維素酶(cellulase)廈門泰京生物技術有限公司；蝸牛酶(snailase)廈門泰京生物技

8、術有限公司；溶壁酶(lywallzyme)廣東省微生物研究所；二硫蘇糖醇(DDT)廈門泰京生物技術有限公司。    滲透壓穩(wěn)定劑分別為0.6mol/L的KCl、NaCl、MgSO4·7H2O、D甘露醇、D山梨醇和蔗糖溶液。    1.4 原生質體的制備    分別挑取一環(huán)雪白白僵菌和茄病鐮刀菌斜面瓊脂培養(yǎng)物接種于PDA液體培養(yǎng)基中，搖瓶裝量為40ml/250ml三角瓶，26、200r/min培養(yǎng)一定時間后投入若干個直徑為0.3mm的玻璃珠，振蕩20min。用玻璃砂心

9、漏斗G3過濾。取0.2g濕菌體，加入1ml 0.01mol/L的DDT，混勻，靜置20min后10000r/min離心10min，棄去上清液，將菌絲體沉淀懸浮于2ml無菌水中，10000r/min離心10min。棄去上清夜，加入1ml不同的酶溶液，混勻，置于28水浴鍋中，每小時用吸管吹吸3次，血球計數(shù)板計數(shù)。酶解結束后補加1ml 0.6mol/L KCl，吹吸3次，用3層擦鏡紙過濾，濾液轉入到離心管中。3000r/min離心7min，棄去上清液，將原生質體懸浮于1ml 0.6mol/L KCl中，血球計數(shù)板計數(shù)。    1.5 原生質體的再生 

10、   將制備好的原生質體懸浮液用0.6mol/L KCl溶液作適當稀釋，于PDA再生培養(yǎng)平板上涂布0.1ml；原生質體再生對照系將原生質體用無菌水進行低滲處理，后涂布于再生培養(yǎng)基上。26培養(yǎng)57d觀察再生菌落，同時進行再生菌數(shù)計數(shù)：    再生率=實驗組再生菌落數(shù)-對照組再生菌落數(shù)原生質體數(shù)×100%        2 結果與討論    2.1 酶液組成對原生質體形成的影響  

11、  采用溶壁酶、蝸牛酶和纖維素酶組成9組酶液分別酶解菌齡為24h的雪白白僵菌和茄病鐮刀菌菌絲，以0.6mol/L的KCl為穩(wěn)定劑(pH6.0，反應溫度28，反應時間4h)，結果見表1。    由表1看出，溶壁酶與蝸牛酶混合液酶解菌體時，形成原生質體量最多。不同種類的真菌制備原生質體所需條件和生成的量相差較大，雪白白僵菌形成原生質體需酶濃度較低(0.5%溶壁酶 0.5%蝸牛酶)，形成原生質體較多，達到8.0×107個/ml(圖1A)。茄病鐮刀菌在較高濃度酶液(1%溶壁酶 1%蝸牛酶)中形成5.3×105個/ml原生質

12、體(圖1B)。利用復合酶進行破壁，效果比單個酶作用好。單用纖維素酶或蝸牛酶作用于菌絲體未發(fā)現(xiàn)原生質體的產(chǎn)生，而單用溶壁酶可以水解細胞壁結構產(chǎn)生原生質體，并且在蝸牛酶輔助作用下原生質體數(shù)量達到最多。    2.2 菌齡對原生質體形成的影響    菌齡是制備原生質體過程中重的因素。以0.6mol/L的KCl為穩(wěn)定劑(pH6.0，反應溫度28)，4h后觀察，結果如圖2。在26培養(yǎng)28h的雪白白僵菌或培養(yǎng)16h的茄病鐮刀菌菌絲制備的原生質體量最多，表明該時期細胞壁結構正適合于制備原生質體。對表1  &#

13、160; 酶液組成對原生質體形成的影響數(shù)期前的菌絲細胞結構對降解酶不敏感，細胞壁和原生質體膜難于分離，造成原生質體釋放困難6。處于對數(shù)生長期的年輕菌絲易于酶解，此時菌絲體內(nèi)源溶壁酶分泌量大，有利于原生質體的釋放7，8。            作者：林永勉 鄭孝賢 鄭衛(wèi) 程元榮【摘】以環(huán)孢菌素A兩種不同產(chǎn)生菌雪白白僵菌和茄病鐮刀菌為出發(fā)菌株，開展         本篇論文是由3COME文檔

14、頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們。    2.3 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質體形成的影響    滲透壓穩(wěn)定劑的性質和濃度是維持和控制原生質體數(shù)量的重因素。分別以0.6mol/L穩(wěn)定劑D山梨醇、蔗糖、D甘露醇、NaCl、KCl和MgSO4·7H2O制備原生質體，結果表明，雪白白僵菌在0.6mol/L NaCl下制備的原生質體數(shù)量最多，茄病鐮刀菌以0.6mol/L NaCl和MgSO4

15、83;7H2O為穩(wěn)定劑時原生質體數(shù)量最多(表2)。    2.4 溫度對原生質體形成的影響    依據(jù)酶反應動力學原理，原生質體制備液的酶解溫度和pH均可直接影響酶促反應的速率和原生質體化程度。在不同的溫度下進行酶解，結果發(fā)現(xiàn)兩種菌絲酶解4h后，茄病鐮刀菌在32形成原生質體數(shù)最多，而雪白白僵菌在2836范圍內(nèi)都可以獲得較多的原生質體數(shù)量(圖3)。 表2    透壓穩(wěn)定劑對原生質體形成的影響    2.5 pH對原生質體形成的影響

16、0;   比較酶液在pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的0.2mol/L檸檬酸鈉磷酸氫二鈉緩沖液里作用原生質體，結果表明在pH6.07.0范圍內(nèi)對二種菌的原生質體制備均無明顯影響(圖4)。    2.6 酶解時間對原生質體形成的影響    酶解時間是制備原生質體又一個重因素。酶作用時間不夠，原生質體不能得到全部釋放。但酶作用時間過長，原生質體膜穩(wěn)定性降低，導致原生質體破碎9。雪白白僵菌在酶液32作用下，3h后獲得最多的原生質體數(shù)。而茄病鐮刀菌4h后原生質體數(shù)量達到最多(圖5)。

17、    2.7 原生質體再生    原生質體融合育種最重的一個環(huán)節(jié)是必須使原生質體再生成細胞，然后才能在普通培養(yǎng)基上繁殖。分別以0.6mol/L D山梨醇、蔗糖、D甘露醇、NaCl、KCl和MgSO4·7H2O作為穩(wěn)定劑制備PDA再生培養(yǎng)基，26培養(yǎng)5d后獲得再生菌落(表3)。    不同菌種的原生質體再生能力相差較大，再生培養(yǎng)基中的穩(wěn)定劑對再生率影響也比較大。雪白白僵菌在以KCl為穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中的再生率為4.7%，而在以山梨醇為穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中幾乎沒有生長。雪白

18、白疆菌原生質體制備率較高，但再生率較低，其原因可能是大多數(shù)原生質體缺乏細胞核或丟失某些細胞器而不能再生10。茄病鐮刀菌制備率低，再生率高，在以KCl為穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中，其再生率高達26%。茄病鐮刀菌原生質體不能在以山梨醇和甘露醇為穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中再生。表3    原生質體再生率由于絲狀真菌的細胞壁組成較為復雜，因此獲得大量活力較高的原生質體，選擇適宜的制備和再生條件非常重。通過以上實驗確定了雪白白疆菌和茄病鐮刀菌的原生質體制備和再生條件，為下一步開展原生質體目間融合的研究打下良好的基礎，相關的研究工作正在進行中?！緟⒖嘉墨I】1 張之盟. 新型免疫抑制劑環(huán)

19、孢素AJ. 抗生素，1986，11(5)：4482 Von Wartburg A, Traber R. Cyclosporins, fungal metabolites with immunosuppressive activities J. Prog Med Chem,1988,25:13 唐信東，洪麗娜，繆冒城，等. 鐮刀菌411產(chǎn)生環(huán)孢素 鐮刀菌411的鑒定及生物學特性J. 抗生素，1984，9(1)：14 洪麗娜，唐信東，繆冒城，等. 鐮刀菌411產(chǎn)生環(huán)孢素 提取，分離，純化和鑒別J. 抗生素，1984，9(1)：55 Kim J, Woo L, Kwang M, et al. PCT Int. APPL P. WO 9612