核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其意義

1、    核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其意義作者：朱娟，肖菊香，張彥兵，王妍華，常浩，吳俊蘭，張磊，王樂作者單位：西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西 西安 710061   【摘要】  目的：探討核苷酸切除修復(fù)交錯(cuò)互補(bǔ)基因1(ERCC1)在人結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平，分析其與鉑類藥物化療敏感性及生存時(shí)間的關(guān)系. 方法：以西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院行結(jié)直腸癌根治術(shù)患者45例和剖腹探查術(shù)患者18例的標(biāo)本為材料，采用免疫組織化學(xué)Elivision法檢測(cè)其ERCC1表達(dá)水平. 其中40例復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及晚期患者行草

2、酸鉑為基礎(chǔ)方案化療. 所有入組患者隨訪6年. 結(jié)果：腫瘤組織中ERCC1的陽(yáng)性率為52.08，低于對(duì)照組. 病理分級(jí)與ERCC1的陽(yáng)性率之間有關(guān)（P=0.040），病理分級(jí)越高，ERCC1陽(yáng)性率越低，表達(dá)強(qiáng)度越弱. ERCC1陰性者鉑類藥物化療有效率為60.00%(12/20)，而陽(yáng)性者則為25.00%(5/20)，二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.025）；Cox回歸分析顯示ERCC1表達(dá)為結(jié)直腸癌患者獨(dú)立預(yù)后因子（P=0.048）. 結(jié)論： ERCC1表達(dá)可作為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者對(duì)鉑類藥物敏感性及預(yù)后判斷的指標(biāo)之一.【關(guān)鍵詞】  結(jié)直腸腫瘤; 核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1; 免疫組織

3、化學(xué); 耐藥; 草酸鉑Expression of ERCC1 in colorectal cancer and its clinical significanceZHU Juan, XIAO JuXiang, ZHANG YanBing, WANG YanHua, CHANG Hao, WU JunLan,  ZHANG Lei, WANG LeDepartment of Medical Oncology, First Hospital of Xian Jiaotong University, Xian 710061,  China【Abstract】  AIM:

4、 To explore the excision repair crosscomplementing1 (ERCC1) expression level in human colorectal carcinoma, and analyze its relationship with the sensitivity of the platinum drugs and its prognosis. METHODS: Sixtythree archived samples of the patients with colorectal carcinoma were detected by immun

5、ohistochemical staining (Elivision). Fortyfive patients underwent radical surgical treatment and 18 patients exploratory laparotomy. All patients were followed up for 6 years after the operation. Forty advanced cases with recurrence and metastasis received oxaliplatin, significantly lower than that

6、in the control group. The positivity rate was correlated with colorectal cancer histologic grade (P=0.040). The histologic grade higher, the positive rate of ERCC1 lower, the expression intensity weaker. In using oxaliplatin cases, the response rate of the ERCC1 negative group was 60.00% (12/20), th

7、at of the ERCC1 positive group was 25.00% (5/20). There was significant correlation between the expression of ERCC1 and the efficacy of chemotherapy (P=0.025）. The ERCC1 was an independent prognostic factor of colorectal cancer by the COX regression analysis (P=0.048). CONCLUSION: ERCC1 expression m

8、ight be one of the prediction markers of the drug sensitivity of the platinum drugs and of prognosis in colorectal cancer.【Keywords】  colorectal neoplasms;  ERCC1;  immunohistochemistry;  resistance; oxaliplatin0引言DNA修復(fù)異常與腫瘤發(fā)生、腫瘤多藥耐藥性1均有密切聯(lián)系. 其中核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)(nucleotide excision repai

9、r, NER)是機(jī)體抵抗致癌效應(yīng)的主要防御機(jī)制，也是修復(fù)化療藥物所致DNA損傷的主要機(jī)制. 核苷酸切除修復(fù)交錯(cuò)互補(bǔ)基因1（excision repair crosscomplementing1, ERCC1)是NER的限速酶，起著損傷部位的識(shí)別和DNA鏈5-3核酸內(nèi)切酶的作用，與多種腫瘤發(fā)生及鉑類藥物耐藥有關(guān)系. 以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是結(jié)直腸癌綜合治療的重要手段之一，耐藥是導(dǎo)致患者治療失敗的主要原因. 我們通過檢測(cè)結(jié)直腸癌石蠟包埋組織中ERCC1的表達(dá)，分析其與臨床生物學(xué)特點(diǎn)及鉑類藥物化療效果的關(guān)系，探討ERCC1在結(jié)直腸癌發(fā)生中的意義，并提供一個(gè)可逆轉(zhuǎn)耐藥的指標(biāo).1對(duì)象和方法選取200

10、003/200103在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院行結(jié)直腸癌根治術(shù)患者45例和剖腹探察并減瘤術(shù)者18例，共63(男36，女27)例，年齡2475(平均54.56)歲. 部位：結(jié)腸27例，直腸36例. TNM分期：期4例，期20例，期21例，期18例. 期及以上期別臨床資料完整的患者59例術(shù)后均給予化療. 輔助化療患者41例均采用含5Fu/CF方案（5Fu 425 mg/m2, iv，第15日+CF 200 mg/m2, iv，第15日），其中有24例復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后進(jìn)行了含草酸鉑的FULFOX4方案治療(Oxaliplatin 85 mg/m2靜脈滴注，2 h，第1日；CF 200 mg/m2，iv，2

11、 h，第1, 2日；5Fu 400 mg/m2推注，然后600 mg/m2持續(xù)靜脈滴注22 h，第1,2日). 18例晚期患者采用上述FULFOX4方案化療16例，5Fu/CF方案2例. 療程36周期，平均療程4.75周期. 對(duì)有可測(cè)量病灶者采用WHO統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，觀察生存期，若末次隨訪仍然存活則定為截尾值. 隨訪至200705，隨訪率為98%，其中死亡42例. 收集同期行腸鏡檢查病理診斷為正常的結(jié)直腸黏膜標(biāo)本10例，作為正常對(duì)照；結(jié)直腸癌標(biāo)本中非癌組織的部分10例，作為癌旁組織對(duì)照.1.2.1免疫組化檢測(cè)ERCC1的表達(dá)取上述庫(kù)存蠟塊切成5 m厚切片，常規(guī)脫蠟至水，用免疫染色Eliv

12、ision法，DAB顯色進(jìn)行ERCC1相關(guān)抗原的免疫組化染色. 試驗(yàn)中一抗為1100稀釋的小鼠抗ERCC1單克隆抗體，二抗為即用型第二代免疫組化Elivision TM加光譜試劑盒，均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司. 以福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供的陽(yáng)性對(duì)照片作為陽(yáng)性對(duì)照；以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照.1.2.2結(jié)果判定本實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Fromowitz等2綜合計(jì)分法，由陽(yáng)性著色細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)與細(xì)胞著色強(qiáng)度二者結(jié)合起來計(jì)算. 陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為10個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)占這10個(gè)視野中細(xì)胞數(shù)的百分比：<5%計(jì)0分；5%25%計(jì)1分；26%50%計(jì)2分；51%75%計(jì)3分；>

13、75%計(jì)4分. 細(xì)胞著色強(qiáng)度：不著色計(jì)0分；淡黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分. 二者積分相加：01分為陰性，2分為陽(yáng)性.Square檢驗(yàn)，KaplanMeier比較生存曲線，并經(jīng)logrank檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1ERCC1的表達(dá)ERCC1主要分布于腫瘤細(xì)胞胞核中，色黃，分布均勻，顆粒細(xì)(圖1)；某些細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)（圖2），集中于核膜周圍. 人結(jié)直腸癌組織中ERCC1陽(yáng)性率為52.38%；癌旁組織中陽(yáng)性率為80.00%；正常結(jié)直腸粘膜組織中陽(yáng)性率為90.00%. 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，癌組織與癌旁組織、正常組織中ERCC1的陽(yáng)性率有差異（P值分別為0.017

14、, 0.014）；正常組織與癌旁組織無顯著性差異（P=0.523）. 癌組織中ERCC1低水平表達(dá).63例結(jié)直腸癌標(biāo)本中，病理學(xué)分級(jí)為級(jí)者11例，陽(yáng)性率81.81；級(jí)者34例，陽(yáng)性率52.94；級(jí)者18例，陽(yáng)性率33.33. 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，病理分級(jí)與ERCC1表達(dá)之間有關(guān)（P=0.040）. 病理分級(jí)越高，ERCC1陽(yáng)性率越低，表達(dá)強(qiáng)度越弱. ERCC1表達(dá)與性別、年齡、部位、分期無關(guān)（表1）.表1ERCC1表達(dá)與結(jié)直腸癌生物學(xué)特點(diǎn)的關(guān)系（）59例化療患者中可評(píng)價(jià)療效者42例. 其中草酸鉑組40例，總有效率為42.50（17/40）；ERCC1陰性者化療有效率為60.00%(12/20)，陽(yáng)性

15、者有效率為25.00%(5/20). 二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（2=5.013，P=0.025），ERCC1陰性者化療有效率高于陽(yáng)性者.ERCC1表達(dá)陽(yáng)性與陰性患者的生存曲線分析顯示ERCC1陰性患者5 a生存率為53.33%, ERCC1陽(yáng)性患者為27.27%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(2=4.459，P=0.035). Cox回歸分析顯示ERCC1表達(dá)（P=0.048）為結(jié)直腸癌患者獨(dú)立的預(yù)后因子（圖3）.3討論NER系統(tǒng)是DNA最主要的修復(fù)機(jī)制，其功能異常在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用3. ERCC1在NER系統(tǒng)中起著損傷識(shí)別和核酸內(nèi)切酶的雙重功能，其表達(dá)水平可以代表NER系統(tǒng)的活性. ER

16、CC1基因是利用對(duì)紫外線敏感的中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞（CHO）和人類瘤細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞融合和互補(bǔ)試驗(yàn)而克隆出的一種與紫外線敏感的突變型鼠細(xì)胞互補(bǔ)的人類修復(fù)基因，定位于染色體19q13.2，共有四種分子量的mRNA，但只有111 kb的mRNA表達(dá)出Mr為33 00036 000的蛋白時(shí)，才表現(xiàn)其功能. 根據(jù)Ted等4的文獻(xiàn)報(bào)道，ERCC1基因?qū)儆谀[瘤抑制基因中的看家（caretakers）基因的一種.文獻(xiàn)報(bào)道在卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)惡性程度更高的透明細(xì)胞癌中ERCC1表達(dá)比其他病理類型表達(dá)更加低下，說明了ERCC1的表達(dá)與細(xì)胞分化程度有關(guān)系，分化程度越差，修復(fù)功能越低下5. Saeb等6對(duì)156例結(jié)腸癌患者組

17、織和399例正常者進(jìn)行對(duì)照后發(fā)現(xiàn)，二者之間ERCC1的表達(dá)存在差異（P=0.011）. Kwon等7通過免疫組化法檢測(cè)64例進(jìn)展期胃癌患者組織中ERCC1, TS和GSTP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ERCC1陽(yáng)性對(duì)FULFOX方案化療的敏感性顯著低于陰性患者（P=0.045）. 逯曉波等8通過構(gòu)建包含ERCC1基因的表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染UV20細(xì)胞后，通過細(xì)胞抑制率測(cè)定(SRB)評(píng)價(jià)草酸鉑的細(xì)胞毒作用，發(fā)現(xiàn)獲得轉(zhuǎn)染成功的UV20ERCC1細(xì)胞,ERCC1表達(dá)水平增加與草酸鉑敏感性降低密切相關(guān). Azuma等9通過免疫組化法檢測(cè)67例肺癌患者組織中ERCC1,P53及TRK的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ERCCI陰性患者中位無進(jìn)展

18、時(shí)間和總生存時(shí)間均高于陽(yáng)性患者. 本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，說明在結(jié)直腸癌中，ERCC1表達(dá)可作為預(yù)測(cè)草酸鉑化療敏感性的指標(biāo)之一. 其主要機(jī)制可能為鉑類藥物作用后，受損細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，而ERCC1過表達(dá)可使停滯在G2/M期損傷的DNA迅速修復(fù)，受損腫瘤細(xì)胞存活增多.近年來,通過反義RNA干擾ERCC1 mRNA的表達(dá)以及其他用分子生物學(xué)手段作用于ERCC1可以逆轉(zhuǎn)鉑類藥物耐藥. Selvakumaran等10通過反義RNA方法作用于對(duì)順鉑敏感的A2780細(xì)胞系和順鉑高度耐藥的OVCAR10細(xì)胞系的ERCC1基因，使得耐藥株的IC50值明顯下降. 劉國(guó)艷等11通過RNA干擾技術(shù)抑制

19、卵巢上皮性癌ERCC1，發(fā)現(xiàn)能增加卵巢癌細(xì)胞ES2對(duì)順鉑的敏感性. 今后有望通過干擾ERCC1的表達(dá)來提高鉑類藥物化療療效.【參考文獻(xiàn)】  1Iqbal S，Stoehlmacher J，Lenz HJ，et al. Tailored chemotherapy for colorectalcancer: A new approach to therapy J. Cancer Invest，2004，22(5)：762-773.2Fromowitz FB，Viola MV，Chao S，et al. Ras p21 Espression in the progression of br

20、east cancer J. Hum Pathol, 1987，18(12)：1268-1275.3Bartels CL，Lambert MW. Domains in the XPA protein important in its role as a processivity factor J. BBRC，2007，356(1)：219- 225.4Ted BT，Larsson C，Nordenskjold M，et al. Tumor suppressor genes(TSG) J. Anticancer Res，1999，19(6A)：4715-4728.5Reed E，Yu JJ，Da

21、vies A，et al. Clear cell tumors have higher mRNA levels of ERCC1 and XPB than other histological types of epithelial ovarian cancer J. Clin Cancer Res，2003，9(14)：5299-305.6Saeb M，Skjelbred CF，Nex BA，et al. Effects of polymorphisms in ERCC1, ASE1 and RAI on the risk of colorectal carcinomas and adenomas: a case control studyJ. BMC Cancer，2006，6：175-180.7Kwon HC，Roh MS，Oh SY，et al. Prognostic value of expression of ERCC1，thymidylate synthase, and glutathione S