清肺口服液對3I、7b型腺病毒感染人胚肺成纖維細胞TGF-β

1、清肺口服液對3I、7b型腺病毒感染人胚肺成纖維細胞TGF-1、PDGF-BB mRNA基因表達的影響         11-05-04 14:58:00     編輯：studa20                         作者：王

2、文革,陳四文,汪受傳【摘要】  目的 觀察清肺口服液含藥血清對腺病毒3I、7b感染的人胚肺成纖維細胞轉(zhuǎn)化生長因子-1(TGF-1)、血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)mRNA基因表達的影響。方法 以3I、7b型腺病毒分別攻擊體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細胞,制備清肺口服液含藥血清,作用于該細胞,另設正常細胞組、病毒對照組、利巴韋林組,采用原位雜交法檢測TGF-1、PDGF-BB mRNA基因的表達,進行各組間比較。結(jié)果 病毒對照組較正常細胞組的TGF-1、PDGF-BB mRNA表達均明顯升高(P0.01),含藥血清組對3I、7b型攻擊后的TGF-1、PDGF-BB mRNA表達均

3、有顯著降低作用(P0.01)。結(jié)論 清肺口服液可下調(diào)TGF-1、PDGF-BB mRNA表達,這可能是其抗病毒作用的機制之一。 【關(guān)鍵詞】  清肺口服液；人胚肺成纖維細胞；腺病毒；轉(zhuǎn)化生長因子-1；血小板衍生生長因子-BB mRNA；含藥血清    Abstract：Objective To study the effect of Qingfei oral liquid contained serum on the transforming growth factor-1 (TGF-1) and platelet-derived growth facto

4、r-BB (PDGF-BB) mRNA gene expression of human embryonic lung fibroblast cells infected by adenovirus (ADV) type 3I and 7b. Method TGF-1 and PDGF-BB mRNA expression of human embryonic lung fibroblast cells infected by ADV type 3I and 7b were determined by in situ hybridization before and after treated

5、 with Qingfei oral liquid contained serum. Results ADV could up-regulate TGF-1 and PDGF-BB mRNA of human embryonic lung fibroblast cells (P0.01), while Qingfei oral liquid could down-regulate them (P0.01, P0.05). Conclusions Qingfei oral liquid played an antiviral role by decreasing the TGF-1 and PD

6、GF-BB mRNA expression.    Key words：Qingfei oral liquid；human embryonic lung fibroblast cells；adenovirus；TGF-1；PDGF-BB mRNA；drug contained serum     清肺口服液是臨床治療小兒病毒性肺炎的有效藥物,前期的藥效學研究已顯示其具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、解熱、止咳、化痰及體外抑菌等作用1。進一步實驗表明,腺病毒攻擊體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細胞后,可使其轉(zhuǎn)化生長因子-1(TGF-1)、血小板衍生

7、生長因子-BB(PDGF-BB)蛋白表達明顯升高2,而清肺口服液可有效降低此種表達。在此基礎上,我們采用原位雜交的方法,對體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細胞TGF-1、PDGF-BB mRNA表達進行了研究,探討TGF-1、PDGF-BB在病毒性肺炎發(fā)病中的作用以及清肺口服液對它們的影響,闡明清肺口服液治療病毒性肺炎的分子生物學機制。1  實驗材料1.1  動物  大耳白兔10只,雌雄各半,健康無病,體重2.53 kg,南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。1.2  細胞  人胚肺成纖維細胞CCC-HPF-1,中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心提供。本實驗

8、采用第530代細胞。1.3  病毒  腺病毒3I、7b型,白求恩醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院兒科提供,南京醫(yī)科大學微生物中心在人胚腎細胞上增殖活化。1.4  藥物及含藥血清制備  清肺口服液：主要藥物為麻黃、葶藶子、虎杖等,南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室負責制劑和質(zhì)量控制,每1 mL含原藥材1 mg。含藥血清及空白血清的制備：將動物隨機分為2組,A組灌服清肺口服液,給藥劑量25 g/kg,分2次給予(相當于臨床等效劑量)；B組給相應體積的生理鹽水,連續(xù)給藥3 d。末次給藥后禁食不禁水12 h,再灌服1 d的量,1 h后,清醒狀態(tài)下行頸動脈分離插管采血,血液靜置3

9、0 min后,離心取血清, 56 水浴30 min滅活,在超凈工作臺上過濾除菌,分裝于1.5 mL EP管,-70 冰箱保存?zhèn)溆谩組為清肺口服液含藥血清,B組為空白血清。利巴韋林注射液：華北制藥有限公司生產(chǎn),規(guī)格：100 mg/mL(支),批號020244。1.5  試劑  RPMI-1640培養(yǎng)基(美國GIBICO公司)；新生牛血清(杭州四季青公司)；胰蛋白酶(美國GIBICO公司)；多聚賴氨酸(武漢博士德公司)；DEPC(美國AMRESCO公司)人TGF-1、PDGF-BB原位雜交試劑盒(武漢博士德公司),試劑盒中包括胃蛋白酶2 mL,預雜交液2 mL,TGF-1、P

10、DGF-BB寡核苷酸探針雜交液各2 mL,封閉液5 mL,生物素化鼠抗地高辛5 mL,SABC-POD 5 mL,生物素化過氧化物酶5 mL。1.6  儀器二氧化碳培養(yǎng)箱BNP-310(TABAI ESFEC日本),超凈工作臺,超低溫冰箱(日本SANYO),離心機,倒置顯微鏡CK(日本OLYMPUS),細胞培養(yǎng)板(美國GIBICO公司),SHZ-ZZ水浴恒溫振蕩器(中國華美生化儀器廠)。     11-05-04 14:58:00     編輯：studa202  實驗方法2.1  細

11、胞分組  共分3I型、7b型腺病毒兩大組,每組又分5個小組：正常細胞組、病毒對照組、利巴韋林組、含藥血清組、空白血清組。2.2  細胞培養(yǎng)  將復蘇后的人胚肺成纖維細胞以2×105/mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,加入3 mL RPMI-1640培養(yǎng)基(含終濃度青霉素、鏈霉素各100 U/mL,20%新生牛血清),置37 、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞基本長滿瓶壁后,用0.25%胰蛋白酶消化,進行傳代培養(yǎng)。2.3  細胞處理及原位雜交  將濃度為2×105/mL的人胚肺成纖維細胞細胞懸液種于內(nèi)置玻片的24孔板中,每孔

12、1 mL。置37 、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞長滿玻片約80%備用。吸去培養(yǎng)液,除正常細胞組外,病毒對照組、含藥血清組、利巴韋林組、空白血清組均加入單倍稀釋的100 TCID50病毒液0.2 mL,置37 、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h。棄去病毒液,PBS洗2次,分別加入維持液稀釋的10%清肺口服液含藥血清、1 mg/mL利巴韋林、10%空白血清；正常細胞組和病毒對照組只加維持液,置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h終止。0.1 mmol/L PBS洗2 min×3次。4%多聚甲醛0.1 mmol/L PBS(pH 7.27.6,含1/1 000 DEPC)固定2030 min。蒸餾水充分洗

13、滌,干燥后-20 保存,進行原位雜交。具體操作步驟按試劑盒說明書,DAB顯色后,在光鏡200倍視野下,每組隨機選取20個細胞,使用北航醫(yī)學圖像分析管理系統(tǒng)測定細胞內(nèi)雜交顆粒的平均光密度值,代表mRNA表達量。3  統(tǒng)計學方法     實驗數(shù)據(jù)以x±s表示。應用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理,采用方差分析進行各組間比較。4  結(jié)果    體外培養(yǎng)的正常人胚肺成纖維細胞可見TGF-1、PDGF- BB mRNA的表達,細胞胞漿著色呈紫藍色。腺病毒3I、7b兩型攻擊該細胞后,細胞TGF-1

14、、PDGF-BB mRNA的表達均明顯升高(P0.01),表現(xiàn)為胞漿平均光密度值升高。利巴韋林組及含藥血清組對3I、7b兩型攻擊后的TGF-1、PDGF-BB mRNA表達均有顯著降低作用(P0.01),而二者比較無統(tǒng)計學意義 (P0.05)?？瞻籽褰M與含藥血清組比較差異有統(tǒng)計學意義。空白血清組與病毒對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)果見表1、表2。表1  清肺口服液對3I、7b型腺病毒攻擊后細胞TGF-1 mRNA的影響；與病毒對照組比較,*P0.01(下同)表2  清肺口服液對3I、7b型腺病毒攻擊后細胞PDGF-BB mRNA的影響(略) 

15、60;                                                 

16、60;     5  討論    目前研究表明,多種生長因子參與肺的炎癥反應,其中TGF-1、PDGF-BB、成纖維細胞生長因子(FGF)等對調(diào)控肺成纖維細胞分裂、增殖及膠原蛋白的合成與降解起十分重要的作用3。近年來許多研究顯示,TGF-1 mRNA的高度表達可激發(fā)肺泡炎癥,它在肺泡急性炎癥及間質(zhì)性肺炎中發(fā)揮重要作用4。PDGF的生物學效應與TGF-1相類似,對多種炎細胞及成纖維細胞有趨化作用,它和TGF-1一起必將加重炎癥反應與細胞過度增殖及各種細胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放,促進肺泡炎及肺纖維化形成?；赥GF-1與

17、PDGF眾多的生物學效應,二者與肺纖維化、慢性阻塞性肺病及哮喘等呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病的關(guān)系越來越引起人們的關(guān)注。    腺病毒肺炎的主要病理改變?yōu)橹夤苎缀头闻蓍g質(zhì)炎,重者可致肺纖維化、肺不張,其病理過程與肺纖維化、慢性阻塞性肺病、哮喘等與TGF-1和PDGF-BB密切相關(guān)的疾病又有許多相似之處。因此,TGF-1和PDGF-BB很可能在腺病毒肺炎的發(fā)病中發(fā)揮著某種調(diào)節(jié)作用。TGF-1和PDGF-BB是否參與了病毒性肺炎的病理過程,并在其中發(fā)揮著怎樣的作用尚未見文獻報道。腺病毒3I、7b是引起腺病毒肺炎的主要基因組型5,我們前期的研究表明,體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細胞經(jīng)

18、腺病毒3I、7b攻擊后,經(jīng)ELISA法檢測,其細胞上清液中TGF-1和PDGF-BB含量較正常組明顯增高,本實驗進一步證實腺病毒感染可使二者的mRNA表達增高,說明病毒感染不僅可在蛋白質(zhì)水平而且可從mRNA水平上調(diào)二者的表達,TGF-1和PDGF-BB可能參與了腺病毒肺炎的發(fā)病過程。但病毒性肺炎的發(fā)病是復雜的,是多種細胞因子共同作用的結(jié)果,二者在其中究竟通過何種途徑起作用尚需要更多的實驗加以闡明。清肺口服液含藥血清可使病毒攻擊過的人胚肺成纖維細胞TGF-1和PDGF-BB mRNA表達下調(diào),說明其可以通過對TGF-1和PDGF-BB mRNA的影響,從基因水平對炎癥細胞因子加以干預,阻斷病毒性肺炎的發(fā)病過程,這可能是其抗病毒作用的機制之一?！緟⒖嘉墨I】  1 汪受傳,朱先康,韓新民,等.小兒病毒性肺炎中醫(yī)證治規(guī)律的初步研究J.中國醫(yī)藥學報,2003,18(12)：694.2 王文革,陳四文,汪受傳.清肺口服液對3I、7b型腺病毒感染人胚肺成纖維細胞轉(zhuǎn)化生長因子-