缺血性卒中急性期患者紅細(xì)胞調(diào)控白細(xì)胞介素 - 18 新的實驗

1、缺血性卒中急性期患者紅細(xì)胞調(diào)控白細(xì)胞介素 - 18 新的實驗體系研究         09-08-03 08:43:00     作者：柴長鳳 郭峰 丁素菊    編輯：studa20【摘要】  目的：采用血液免疫反應(yīng)路線圖實驗體系探討缺血性卒中急性期患者紅細(xì)胞調(diào)控白細(xì)胞分泌 IL-18 的能力。方法：將缺血性卒中急性期患者組分為 2 組即大、中小梗死組。將癌細(xì)胞（S180）懸液 0.2 mL（10×106/mL）或

2、生理鹽水 0.2 mL 加至枸櫞酸抗凝全血細(xì)胞懸液（或白細(xì)胞懸液）0.2 mL 和血漿 0.3 mL 中，37 水浴 1 h，酶聯(lián)免疫法測定反應(yīng) 液中 IL-18 含量。結(jié)果：大梗死組 IL-18 的含量明顯高于中小梗死組和對照組（P < 0.01）。中小梗死組無抗原激活組（0.32±0.34）高于抗原激活組（-0.41±0.74）和對照組無抗原激活組（-0.20±0.50）紅細(xì)胞對白細(xì)胞分泌 IL-18 的調(diào)控率（P < 0.05）。結(jié)論：動脈粥樣硬化階段就已經(jīng)存在紅細(xì)胞免疫功能的下降，梗塞時更為明顯。紅細(xì)胞對白細(xì)胞分 泌 IL-18 具有吸附下調(diào)作

3、用，疾病嚴(yán)重時處于失調(diào)控階段。 【關(guān)鍵詞】  癌；缺血性卒中，急性期；變態(tài)反應(yīng)和免疫學(xué)；紅細(xì)胞；白細(xì)胞介素-18    Abstract  Objective  To  approach  the  capacity  of  erythrocyte  regulating  IL-18  in  patients  with  acute  ischemic  stroke  (AIS)

4、0; by  a  new  experimental  system  of  hemaimmune.   Methods  Patients  with  AIS  were  divided  into  two  groups  of  the  large,  the  midst  and  small  by  the  v

5、olume  of  infarction  and  made  group  comparison.  0. 2  mL  suspension  of  cancer  cells  (S180:10 ×106/mL)  or  NS  were  added  into  0.2  mL  anticoagulant suspension  of 

6、whole  blood  cells  or  leukocytes  and  0.3  mL  plasma,  then  incubated  for  1 h  at  37.  The content  of  IL-18  was  determined  by  ELISA.    Results   

7、0; The  content  of  IL-18  in  the  large  group  was  much higher  than  those  of  the  others.  The  regulative  capacity  of  erythtocyte  to  IL-18  with  cancer  cells 

8、 was  lower  than  without  in  the  midst  and  small  group,  and  also  was  lower  than  that  of  the  control  group  with  cancer  cells.   Conclusion    

9、; When  in  the  period  of  atherosclerotic,  the  immunity  erythrocyte  had  been  declined.  And  it  declined  more  when  in  AIS.  It  could  absorb  IL-18,  while  it 

10、 was  in  imbalance  when  the  disease  was  serious.    Key  Words    Carcinoma;  Ischemic  stroke;  Acute;  Allergy  and immunology;  Erythrocytes;  Interleukin-18    IL-18 作為一種

11、新近發(fā)現(xiàn)的促炎細(xì)胞因子，機(jī)體的眾多器官、組織和細(xì)胞都可檢測到 IL-I8 mRNA 的存在，外周血單核細(xì)胞經(jīng)內(nèi)毒素（LPS）刺激也有表達(dá)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞1、星型膠質(zhì)細(xì)胞2、神經(jīng)元和室管膜細(xì)胞3也可產(chǎn)生。IL-18 能夠有力地激活 T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子。研究表明，IL-18 參與動脈粥樣硬化和缺血性腦卒中的病理過程。    本實驗采用“血液免疫反應(yīng)路線圖”4理論構(gòu)建的自然與分離的實驗體系，測定缺血性卒中急性期紅細(xì)胞調(diào)控白細(xì)胞分泌 IL-18 的水平，證實癌細(xì)胞可以激活白細(xì)胞分泌 IL-18，紅細(xì)胞可以吸附白細(xì)胞分泌的 IL-18，同時也證

12、明了缺血性卒中急性期紅細(xì)胞免疫功能低下，對白細(xì)胞分泌 IL-18 調(diào)控的能力處于失平衡狀態(tài)。    1    材料與方法    1.1    研究對象    缺血性卒中急性期患者 11 例新鮮枸櫞酸抗凝血標(biāo)本，其中男 8 例，女 3 例，年齡 4066 歲，平均（52.0±5.8）歲，診斷均符合 1995 年全國第 4 屆腦血管病會議制定的標(biāo)準(zhǔn)，且均在入院后 3 d 內(nèi)行頭顱 CT 或 MRI 檢查證實。按 Pullicino 公式計算

13、腦梗死體積，即：腦梗死體積（cm3）= 長×寬×CT 掃描陽性層面數(shù)×/6。按腦梗死灶體積大小將病例分為中小梗死灶組（1.68.0 cm3，n = 8）和大梗死灶組（> 8 cm3，n = 3）。伴有自身免疫性疾病、惡性腫瘤、感染或正在服用激素治療、體溫超過 37.5及嚴(yán)重心、肝、腎疾病或 3 個月內(nèi)有腦卒中史者均排除在外。對照組為存在卒中危險因素但未發(fā)生卒中的亞健康者：其中男 5 例，女 2 例，年齡 4064 歲，平均（51.0±6.0）歲。所有入選病例均行頸動脈超聲檢查，3 組患者在動脈硬化程度以及年齡上相匹配，無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P >

14、 0.05）。    1.2    材料    IL-18 酶聯(lián)免疫試劑盒（法國 Diaclone 公司，批號：H0182710），癌細(xì)胞冰凍試劑（S180 株，濃度為 5×106/mL，長海醫(yī)院輸血科血液免疫研究室制備）。    1.3    方法    1.3.1    癌細(xì)胞 S180 激活全血細(xì)胞和白細(xì)胞分泌IL-18 測定法    癌細(xì)胞

15、 S180 用生理鹽水配成 10×106/mL?？鼓诫x心分離血漿，放另一試管備用。沉淀血細(xì)胞用生理鹽水沉淀洗滌 1 次并恢復(fù)原體積為全血細(xì)胞懸液混勻備用。正式試驗；第 1 試管（試管 1）加 0.2 mL 全血細(xì)胞，加 0.2 mL 癌細(xì)胞懸液，再加 0.3 mL 血漿，為癌細(xì)胞激活全血實驗組（NEG）。第 2 試管（試管 2）加 0.2 mL 全血細(xì)胞，加 0.2 mL 生理鹽水，再加 0.3 mL 血漿，為全血細(xì)胞生理鹽水組（NCG）。    再取兩支試管（10 mL 規(guī)格試管）分別加入 0.2 mL 全血細(xì)胞懸液，用 12 mL 蒸餾水在冰水

16、中輕輕吹打 1 min 破壞紅細(xì)胞后再加等量的高滲鹽水恢復(fù)等滲，再加生理鹽水至滿，輕輕吹打洗滌，離心后倒盡上清液，第 1 試管（試管 3）加 0.2 mL 全血細(xì)胞和 0.3 mL 血漿，為癌細(xì)胞激活白細(xì)胞組（IEG）。第 2 試管（試管 4）加 0.2 mL 生理鹽水，再加 0.3 mL 血漿，為白細(xì)胞生理鹽水組（ICG）。試管1、2、3 和 4 分別混勻后 37水浴 1 h 后，離心，取上清液，置于 - 200冰箱凍存。用酶聯(lián)免疫法測定反應(yīng)液中 IL-18 含量，按公式算出各自標(biāo)本紅細(xì)胞 IL-18 調(diào)控率（%）=IEG 中 IL-18 含量（或 ICG 中 IL-18 含量）- NEG

17、中 IL-18 含量（或 NCG 中IL-18 含量）/ IEG 中 IL-18 含量（或 ICG 中 IL-18 含量）。紅細(xì)胞對 IL-18 的激活指數(shù)（%）=IEG 中 IL-18 含量（或 NEG 中 IL-18 含量）- ICG 中 IL-18 含量（或 NCG 中 IL-18 含量）/ IEG 中 IL-18 含量（或 NCG 中 IL-18 含量）。    1.4    統(tǒng)計學(xué)處理    數(shù)據(jù)結(jié)果以 x±s 表示，組間比較采用 t 檢驗。    2&#

18、160;   結(jié)    果    2.1    病例組中大梗死組各項指標(biāo)結(jié)果與中小梗死組及對照組 IL-18 各項指標(biāo)結(jié)果    見圖 1。大梗死組中各組指標(biāo)均明顯高于相應(yīng)中小梗死組及對照組的 IL-18 含量（P < 0.001）。且中小梗死組也均高于對照組相應(yīng)各組數(shù)據(jù)，但無統(tǒng)計意義。    2.2    癌細(xì)胞 S180 激活紅細(xì)胞增強(qiáng)白細(xì)胞分泌 IL-18 測定結(jié)果自然與分離體系比較&

19、#160;   見圖 1。在全血細(xì)胞免疫反應(yīng)中，病例組和對照組均是 NEG 明顯高于 NCG。在白細(xì)胞免疫反應(yīng)中，除中小梗死組 IEG（此組標(biāo)準(zhǔn)差比較大，考慮可能系樣本量比較小的緣故）低于 ICG 外，其余也均是 IEG 高于 ICG。     09-08-03 08:43:00     作者：柴長鳳 郭峰 丁素菊    編輯：studa20    說明：大梗死組 NCG 與中小梗死組及對照組 NCG 比較，P < 0.

20、01；大梗死組 NEG 與中小梗死組及對照組 NEG 比較，P < 0.01；大梗死組 IEG 與中小梗死組及對照組 IEG 比較，P < 0.01；大梗死組 ICG 與中小梗死組及對照組 ICG 比較，P < 0.01。    2.3    癌細(xì)胞 S180 激活全血實驗組和白細(xì)胞組 IL-18 測定結(jié)果比較    見圖 1。在病例組中小梗死組和對照組均是 NEG 高于 IEG 中 IL-18 水平，但在病例組的大梗死組卻出現(xiàn)相反的情況，但是，在更為大面積梗死組中，是否也存在此種邏輯，

21、還有待于擴(kuò)大進(jìn)一步研究。    2.4    NCG 和 ICG 組 IL-18 測定結(jié)果比較    見圖 1。在病例組大梗死組中 NCG 中 IL-18 測定結(jié)果低于 ICG，但在中小梗死組中 ICG 反而高于 NCG，在對照組中，兩者幾乎相等。    2.5    病例組和對照組紅細(xì)胞對白細(xì)胞分泌 IL-18 調(diào)控率結(jié)果比較    見圖 2。對照組和病例組，無抗原時，均是白細(xì)胞組對 IL-18 的調(diào)控率高于或幾乎

22、等于全血細(xì)胞組（其中對照組為 - 0.20±0.50，接近于 0），而在加用抗原刺激的情況下，情況相反，但大梗死組仍如此。    說明：中小梗死組存在癌細(xì)胞情況下與無癌細(xì)胞下調(diào)控率比較，P < 0.05；中小梗死組無癌細(xì)胞情況下與對照組有癌細(xì)胞情況下比較，P < 0.05。    2.6    病例組和對照組癌細(xì)胞對白細(xì)胞分泌 IL-18 激活指數(shù)結(jié)果比較    病例組的中小梗死組和對照組，都是全血細(xì)胞組高于白細(xì)胞組，但大面積梗死組，情況相反，但無統(tǒng)計學(xué)

23、意義。    3    討    論    1981 年美國生殖免疫學(xué)家 Siegel 提出了紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)的概念。2005 年國內(nèi)郭峰提出“紅細(xì)胞天然免疫主干道理論”，并構(gòu)建了快速簡便的“自然和分離實驗體系”的實驗研究方法。    本實驗研究表明，白細(xì)胞分泌 IL-18 的水平與梗死面積相關(guān)，即：梗死面積越大，則 IL-18 水平亦越高。這與 Zaremba 等5報道一致，即：缺血性腦中風(fēng)患者發(fā)病 24 h 內(nèi)血清 IL-18 含量與患者的腦

24、CT  的低密度值等呈顯著的正相關(guān)性。癌細(xì)胞 S180 激活紅細(xì)胞增強(qiáng)白細(xì)胞分泌 IL-18 是一種快速天然免疫反應(yīng)，自然與分離體系的結(jié)果表明，滅活的癌細(xì)胞是一種抗原細(xì)胞，能夠在體外仿真實驗研究體系，本次實驗表明，癌細(xì)胞可快速激活外周血單核細(xì)胞天然免疫反應(yīng)，NCG 中 IL-18 水平相對最低，說明紅細(xì)胞可以吸附下調(diào)白細(xì)胞天然免疫反應(yīng)分泌的 IL-18。對照組中 NCG 與 ICG 中 IL-18 水平基本相同，說明，動脈粥樣硬化患者紅細(xì)胞免疫調(diào)控 IL-18 的功能下降。從紅細(xì)胞對白細(xì)胞分泌 IL-18 調(diào)控率分析，無抗原存在的情況下，由于紅細(xì)胞可以吸附下調(diào)白細(xì)胞分泌 IL-18，

25、使之維持在較低水平，從而阻止炎癥反應(yīng)的繼續(xù)。但在對照組即動脈粥樣硬化患者中，由于紅細(xì)胞免疫功能已下降，因此癌細(xì)胞S180 激活組，此時紅細(xì)胞免疫功能下降更為明顯，故其吸附白細(xì)胞分泌 IL-18 的水平明顯下降，在中小梗死組的病例組中情況類似，但大梗死組卻出現(xiàn)了相反情況，表明此時紅細(xì)胞免疫功能失衡，即對白細(xì)胞分泌 IL-18 處于失調(diào)控狀態(tài)，導(dǎo)致血液循環(huán)中 IL-18 正增長，而 IL-18 又可刺激 TH1 細(xì)胞泌多種細(xì)胞因子6，從而形成惡性循環(huán)，產(chǎn)生毒性產(chǎn)物，進(jìn)一步加重炎性反應(yīng)。從紅細(xì)胞增強(qiáng)抗原激活白細(xì)胞分泌 IL-18 水平來看，大面積梗死組的激活指數(shù)明顯低于其他兩組，也同樣說明此時紅細(xì)胞免疫功能失平衡。因此，如果在缺血性卒中急性期采取某種措施提高紅細(xì)胞的免疫功能，那么紅細(xì)胞調(diào)控吸附 IL-18 的能力就會明顯上升，從而阻止炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步進(jìn)行。    本實驗說明用現(xiàn)代系統(tǒng)免疫學(xué)的理論與方法去研究系統(tǒng)血液天然免疫反應(yīng)的機(jī)理是非常簡單