金邊瑞香對(duì)荷S180瘤小鼠免疫功能的影響(一)

1、金邊瑞香對(duì)荷S180瘤小鼠免疫功能的影響(一)    作者：黃彬紅 傅穎媛 徐靜 曾小平 況南珍 熊麗紅 陳開(kāi)森 周智興 劉婷【摘要】 目的探討金邊瑞香對(duì)荷S180瘤小鼠免疫功能的影響。方法MTT比色法測(cè)定小鼠T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)；雞紅細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)（RBC- C3bRR）法檢測(cè)小鼠紅細(xì)胞免疫功能。結(jié)果20 g/（kg·d），40 g/（kg·d）金邊瑞香能提高荷S180瘤小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，20 g/（kg·d）金邊瑞香可提高荷S180

2、瘤小鼠的紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)結(jié)合率。結(jié)論金邊瑞香對(duì)荷S180瘤小鼠的細(xì)胞免疫、非特異性免疫、紅細(xì)胞免疫功能均有不同程度的促進(jìn)作用。 【關(guān)鍵詞】 金邊瑞香； 荷瘤小鼠； 免疫功能金邊瑞香Daphne odora var. marginata是我國(guó)傳統(tǒng)名花1，以其色、香、姿、韻四絕而具有較高的觀賞價(jià)值，此外金邊瑞香還具有可觀的藥用價(jià)值。金邊瑞香含有瑞香苷，水解生成瑞香素，其根、莖、葉、花均可入藥，性甘無(wú)毒，具有清熱降火、消炎去腫、活血化淤、散結(jié)止痛之功能。據(jù)中藥大辭典匯輯，瑞香葉能治瘡瘍、風(fēng)痛；花可治咽喉牙齒腫痛；根莖能治毒蛇咬傷、跌打損傷等疾病。近年來(lái)對(duì)金邊瑞香的研究及開(kāi)發(fā)逐漸增多。研究表明金邊

3、瑞香具有抗炎癥2、抑菌、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗衰老3和對(duì)正常小鼠的細(xì)胞免疫、非特異性免疫、紅細(xì)胞免疫功能有促進(jìn)等作用4，5，而對(duì)荷瘤小鼠免疫功能方面的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究了金邊瑞香對(duì)荷S180瘤小鼠免疫細(xì)胞功能的影響，以利于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用。1 材料腹水型肉瘤S180小鼠，由贛南醫(yī)學(xué)院分析實(shí)驗(yàn)室李舒梅教授惠贈(zèng)；健康昆明種小鼠，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，雌雄兼用，68周齡，體重1822g，分籠飼養(yǎng)，自由飲水及進(jìn)食。金邊瑞香浸膏，由江西省中醫(yī)藥研究院熊學(xué)敏教授提供，含生藥量5g/ml，臨用時(shí)用蒸餾水配制成所需濃度；RPMI1640, GIBCO公司產(chǎn)品；刀豆蛋白A(ConA)，SIGMA公

4、司產(chǎn)品；小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽(MTT), AMERSCO公司產(chǎn)品；環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品；酵母菌，廣東丹寶酵母有限公司產(chǎn)品。2 方法2.1 荷瘤小鼠模型建立無(wú)菌條件下取傳代79d生長(zhǎng)良好的S180小鼠腹水，用生理鹽水按14稀釋成細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)為4×107/ml），每只小鼠右腋皮下接種0.2ml，24h后隨機(jī)分組。2.2 動(dòng)物分組及給藥實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6組，單純荷瘤模型組給予生理鹽水簡(jiǎn)稱生理鹽水組；實(shí)驗(yàn)組金邊瑞香設(shè)低、中、高3個(gè)劑量組劑量分別為20，40，80 g/（kg·d），灌胃給藥1次/d，0.4 ml/次，連續(xù)

5、給藥10 d；環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組分別于第1，5，9天腹腔注射CTX（環(huán)磷酰胺）100 mg/kg；設(shè)未荷瘤小鼠作正常對(duì)照組，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。2.3 金邊瑞香浸膏對(duì)荷S180瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響 停藥次日處死小鼠，無(wú)菌取脾臟，制成3×106/ml的脾細(xì)胞懸液，96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每個(gè)小鼠脾細(xì)胞分別設(shè)立對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔，均做3個(gè)復(fù)孔。每孔加脾細(xì)胞懸液100 l，細(xì)胞數(shù)為3×105 ，然后實(shí)驗(yàn)孔加ConA，使其終濃度為4 g/ml，對(duì)照孔則加RPMI1640培養(yǎng)液。37,5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)48 h，加人MTT使終濃度為0.5 mg/m1，繼續(xù)培養(yǎng)4h吸去上清100 l，加

6、人DMSO100l每孔，稍振蕩10 min酶標(biāo)儀490波長(zhǎng)測(cè)每孔A值。計(jì)算刺激指數(shù)(SI)SI=實(shí)驗(yàn)孔A均值/對(duì)照孔A均值。2.4 金邊瑞香浸膏對(duì)荷S180瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響灌胃第10天，每只小鼠腹腔注射2%淀粉生理鹽水溶液1 ml，次日，每鼠腹腔注射1%雞紅細(xì)胞懸液lm1,1 h后頸椎脫臼處死小鼠。用1.5 ml生理鹽水沖洗腹腔，取腹腔洗液0.5 ml滴片，干燥后甲醇固定，瑞氏染液染色。油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)和吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。吞噬百分率（%）=100個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/100個(gè)巨噬細(xì)胞×10

7、0%；吞噬指數(shù)=100個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/100個(gè)巨噬細(xì)胞。2.5 金邊瑞香浸膏對(duì)荷S180瘤小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響停藥次日，小鼠眼眶取血，RBC經(jīng)生理鹽水洗滌3次，調(diào)整濃度為1.25×107/ml紅細(xì)胞懸液；酵母菌細(xì)胞濃度調(diào)整為1×108/ml，加等量血清致敏，用生理鹽水洗滌1次，恢復(fù)原濃度，制成補(bǔ)體致敏酵母菌懸液。取紅細(xì)胞懸液50 l、致敏酵母菌懸液50 l混勻，置37水浴30 min，加0.25%戊二醛50 l，輕輕搖勻。取50 l涂片，涼干，瑞氏染液染色。油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，算出RBC-C3b受體花環(huán)率。RBC-C3bRR（%）=200個(gè)RBC中

8、陽(yáng)性花環(huán)數(shù)/200個(gè)RBC×100%2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義再行SNK法兩兩比較。采用SPSS11.5軟件統(tǒng)計(jì)。3 結(jié)果3.1 金邊瑞香浸膏對(duì)荷S180瘤小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響 各組用ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖的刺激指數(shù)（SI）結(jié)果見(jiàn)表1。表1 金邊瑞香浸膏對(duì)荷S180瘤小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響與生理鹽水組比較，*P0.01；與正常對(duì)照組比較，P0.01，P>0.05；n=9由表1可見(jiàn)，金邊瑞香各劑量組與生理鹽水組相比，ConA對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)均有增高，其中40 g/（kg·d）中劑量和20 g/（kg·d）低劑量金

9、邊瑞香組增高明顯（P0.01）。生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組與正常對(duì)照組比較，對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖的刺激指數(shù)均較低，差異有顯著性（P0.01）。3.2 金邊瑞香浸膏對(duì)荷S180瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 各組吞噬率和吞噬指數(shù)的結(jié)果見(jiàn)表2。表2 金邊瑞香浸膏對(duì)荷S180瘤小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 由表2可見(jiàn)，金邊瑞香各劑量組與生理鹽水對(duì)照組比較，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)均有增高，其中40g/（kg·d）中劑量金邊瑞香組增高明顯（P0.05）和20g/（kg·d）低劑量金邊瑞香組增高明顯（P0.01）。生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組與正常對(duì)照組相比，小鼠腹腔巨噬細(xì)

10、胞的吞噬率和吞噬指數(shù)均有降低，差異有顯著性（P0.01）。高劑量組與正常對(duì)照組相比，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)均有降低，差異有顯著性（P0.05）。低劑量組與正常對(duì)照組相比，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率增高，差異有顯著性（P0.05）。3.3 金邊瑞香浸膏對(duì)荷瘤小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響各組紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率的結(jié)果見(jiàn)表3。由表2可見(jiàn)，金邊瑞香浸膏各劑量組的紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率與生理鹽水對(duì)照組相比均有增高趨勢(shì)，其中20 g/（kg·d）低劑量金邊瑞香組與生理鹽水對(duì)照組之間的紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率差異有顯著性（P0.05）。生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組與正常對(duì)照組相比，紅細(xì)胞C3b受體

11、花環(huán)率明顯降低，差異有顯著性（P0.01），低劑量組與正常對(duì)照組比，紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率差異無(wú)顯著性（P>0.05）。表3 金邊瑞香浸膏對(duì)荷S180瘤小鼠RBC-C3b受體花環(huán)形成的影響與生理鹽水組比較，*P0.05，*P0.01；與正常對(duì)照組比較，P0.01，P>0.05；n=94 討論自20世紀(jì)70年代初，瑞香科瑞香屬植物便成了植物化學(xué)和藥學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)6。金邊瑞香作為我國(guó)名貴花卉之一，近年來(lái)對(duì)金邊瑞香的研究及開(kāi)發(fā)逐漸增多。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，免疫功能受損，導(dǎo)致機(jī)體易患腫瘤，而當(dāng)宿主免疫功能恢復(fù)和提高時(shí)，就能有效地排斥腫瘤，控制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因此，正

12、確評(píng)價(jià)荷瘤機(jī)體的免疫功能，研究中藥對(duì)機(jī)體免疫功能的影響是研究中藥抗腫瘤的一個(gè)重要方面。脾是體內(nèi)最大最活躍的免疫器官，脾細(xì)胞的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能是反映機(jī)體T細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。T淋巴細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤的特異性免疫應(yīng)答過(guò)程中處于關(guān)鍵地位。測(cè)定淋巴細(xì)胞體外增殖反應(yīng)是檢測(cè)細(xì)胞免疫功能的常用方法。ConA為最常用的T細(xì)胞絲裂原，可引起非特異的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化7。單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分，也是參與細(xì)胞免疫的重要細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而且可以釋放一些細(xì)胞因子和效應(yīng)分子來(lái)發(fā)揮多種生物學(xué)作用，通過(guò)測(cè)定巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)可以反映其吞噬功能的強(qiáng)弱8。近年來(lái)研

13、究表明，紅細(xì)胞在抗腫瘤免疫反應(yīng)中具有很多作用。作為血循環(huán)中數(shù)量巨大的天然免疫細(xì)胞，紅細(xì)胞 CR 在補(bǔ)體系統(tǒng)及其他天然免疫物質(zhì)協(xié)同作用下，對(duì)血循環(huán)中的癌細(xì)胞會(huì)發(fā)生快速天然免疫。近年還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可通過(guò)旁路途徑激活補(bǔ)體，被紅細(xì)胞CR1免疫粘附，可見(jiàn)紅細(xì)胞在阻止惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移過(guò)程中有一定的作用9。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2040 g/（kg·d）金邊瑞香能提高荷S180瘤小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，20 g/（kg·d）金邊瑞香提高荷S180瘤小鼠的紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)結(jié)合率，說(shuō)明金邊瑞香能明顯增強(qiáng)荷S180瘤小鼠的細(xì)胞免疫、非特異性免疫、紅細(xì)

14、胞免疫功能，以20 g/（kg·d）小劑量金邊瑞香效果更好。環(huán)磷酰胺與正常對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺抑制ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖功能，抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，也抑制紅細(xì)胞免疫功能?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 熊學(xué)敏,方裕華,曹 玨.金邊瑞香鮮花中瑞香素的超臨界萃取及條件的優(yōu)化J.中國(guó)新藥雜志,2003,12(7) :534.2 葉和楊,曾 靖,楊敬格,等.金邊瑞香的抗炎癥作用J.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2002, 22(l):7.3 葉和楊,周 俐,曾 靖,等.金邊瑞香對(duì)小鼠SOD活性及MDA含量的影響J.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,23(3):246.4 徐 靜,傅穎媛.金邊瑞香對(duì)小鼠免疫細(xì)胞的影響J.廣東醫(yī)學(xué),2005,26（9）:1207.5 徐 靜,傅穎媛.金邊瑞香對(duì)小鼠免疫功能影響的量效關(guān)系J.中