黃芩苷對(duì)人牙周膜細(xì)胞RANKLOPG表達(dá)的影響及其作用機(jī)制

1、黃芩苷對(duì)人牙周膜細(xì)胞RANKLOPG表達(dá)的影響及其作用機(jī)制         11-01-07 13:52:00     作者：陳悅，吳織芬，楊連甲    編輯：studa20【摘要】  目的 研究黃芩苷對(duì)人牙周膜細(xì)胞核因子B受體激活物配基和骨保護(hù)素(RANKLOPG)表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。方法 首先構(gòu)建轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子型受體(TGFR)靶向siRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染正常人外周血T細(xì)胞，使T細(xì)胞表面的TGFR基因沉默，繼而將轉(zhuǎn)染

2、與未轉(zhuǎn)染靶向性TGFR基因沉默的T細(xì)胞和正常人牙周膜成纖維細(xì)胞置于加有黃芩苷和內(nèi)毒素的培養(yǎng)基中，分為6組：正常牙周膜成纖維細(xì)胞+內(nèi)毒素+轉(zhuǎn)染siRNA1的T細(xì)胞+黃芩苷;正常牙周膜成纖維細(xì)胞+內(nèi)毒素+轉(zhuǎn)染siRNA1的T細(xì)胞;正常牙周膜成纖維細(xì)胞+內(nèi)毒素+正常T細(xì)胞+黃芩苷;正常牙周膜成纖維細(xì)胞+內(nèi)毒素+正常T細(xì)胞;正常牙周膜成纖維細(xì)胞+黃芩苷;正常牙周膜成纖維細(xì)胞。共培養(yǎng)48h，RTPCR檢測(cè)牙周膜細(xì)胞RANKL和OPG的表達(dá)，計(jì)算RANKL/OPG比值。結(jié)果 酶切鑒定正確的克隆測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的目的序列完全一致;轉(zhuǎn)染siRNA1的T細(xì)胞組的TGFR mRNA的表達(dá)被明顯抑制;RANKL/OP

3、G的比值在各組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 成功構(gòu)建了TGFR靶向siRNA真核表達(dá)載體并成功轉(zhuǎn)染T細(xì)胞;黃芩苷可以降低牙周膜細(xì)胞表面RANKL/OPG比值;TGF的信號(hào)傳導(dǎo)在黃芩苷影響牙周膜成纖維細(xì)胞表面的RANKL/OPG表達(dá)過(guò)程中起著重要作用;黃芩苷并非只通過(guò)TGF信號(hào)傳導(dǎo)通路，而是亦通過(guò)其他通路對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞表面的RANKL/OPG進(jìn)行調(diào)控。 【關(guān)鍵詞】  轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子型受體;小干擾RNA;核因子B受體激活物配基;骨保護(hù)素;牙周膜成纖維細(xì)胞ABSTRACT: Objective To study the effect of baicalin on th

4、e expression of receptor activator of nuclear factorB ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) in cultured human periodontal ligament cells (HPDL cells) as well as its action mechanism. Methods We first constructed small interferring RNA (siRNA) eukaryotic expression vector targeted transforming gro

5、wth factor receptor (TGFR), and then transfected it into T cells. Then HPDL cells together with T cells transfected with siRNA or not were placed in medium that had been added with lipopolysaccharide (LPS) and baicalin. They were divided into six groups and cultured for 48 hours. Reverse transcripta

6、sepolymerase chain reaction (RTPCR) was used to observe the effect of baicalin on OPGRANKL expression in HPDL cells. Results The clone sequence correctly identified by RTPCR was consistent with the designed target sequence. The recombinant vector was constructed successfully and the expression of TG

7、FR of T cells which had been transfected with siRNA1 was inhibited obviously. Ratio of RANKL/OPG in each group differed significantly (P<0.01). Conclusion siRNA eukaryotic expression vector of recombinant targeting gene TGFR has been constructed and it has been transfected T cells successfully; B

8、aicalin can reduce the ratio of RANKL/OPG on PDL cells; TGF signaling transduction plays an important role in the effect of baicalin on RANKL/OPG ratio on PDL cells; Baicalin acts not only through TGF to regulate RANKL/OPG in PDL cells, but also through other pathways.KEY WORDS: transforming growth

9、factor receptor (TGFR); small interfering RNA(siRNA); receptor activator of nuclear factorB ligand (RANKL); osteoprotegerin (OPG); periodontal ligament cells (PDLC)骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)及其配體核因子B受體激活物配基(receptor activator of nuclear factorB ligand, RANKL)是調(diào)控破骨細(xì)胞生成和活化的關(guān)鍵因子，在調(diào)節(jié)骨質(zhì)吸收中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)OPGR

10、ANKL能在人牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontal ligament cell, PDLC)表達(dá)，并受多種因素調(diào)節(jié)13。在口腔局部微環(huán)境中,眾多因素通過(guò)作用于牙周組織，使OPG與RANKL的濃度增加或減少來(lái)調(diào)控局部骨組織代謝。細(xì)菌激發(fā)的訴諸免疫炎癥反應(yīng)是造成和影響牙周組織破壞的主要原因。黃芩苷的抗炎作用則決定了其在牙周病的防治中可能起到重要作用。有研究證實(shí)，黃芩苷、淫羊霍苷和大黃素組合時(shí)可抑制內(nèi)毒素(LPS)刺激下人牙齦成纖維細(xì)胞中前列腺素E2(PGE2)的產(chǎn)生，亦可抑制實(shí)驗(yàn)性牙周炎牙槽骨吸收4。本研究的第一個(gè)目的，即擬通過(guò)觀察黃芩苷對(duì)PDLC上OPGRANKL表達(dá)的影響，從而證實(shí)黃芩苷對(duì)

11、牙槽骨的吸收的調(diào)節(jié)作用。牙周炎時(shí)，T細(xì)胞的數(shù)量、活性增高，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子分泌增加，加重牙周炎癥和骨吸收。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor , TGF)可以抑制T細(xì)胞的活性和增殖56。黃芩苷抗炎作用的機(jī)制也與抑制白介素1(IL1)、腫瘤壞死因子(TNF)等炎性因子的過(guò)度產(chǎn)生有關(guān)78，因而設(shè)想黃芩苷的抗炎抗骨吸收作用可能是通過(guò)TGF實(shí)現(xiàn)的。本研究的第二個(gè)目的，即黃芩苷是否通過(guò)增強(qiáng)TGF對(duì)T細(xì)胞的抑制作用，引起T細(xì)胞活性降低、數(shù)量減少，導(dǎo)致T細(xì)胞在內(nèi)毒素作用下分泌TNF等炎癥因子減少，繼而影響OPGRANKL，降低破骨細(xì)胞形成，從而減少骨丟失。為達(dá)到以上兩個(gè)研究目

12、的，本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子型受體(transforming growth factor receptor, TGFR)的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，隨后將正常PDLC與轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染siRNA的T細(xì)胞置于加有內(nèi)毒素和黃芩苷的培養(yǎng)液中，觀察黃芩苷對(duì)正常PDLC上OPGRANKL表達(dá)的影響。1 材料與方法1.1 TGFR靶向siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中報(bào)道的TGFR核苷酸序列，參考siRNA的設(shè)計(jì)原則，按照pSilencer3.1H1載體的設(shè)計(jì)要求，設(shè)計(jì)2條siRNA序列。TGFR siRN

13、A轉(zhuǎn)錄模板由北京華大公司合成，RNAi TGFR目標(biāo)序列依次為：5GATCCGCAGCATGTGTATAGCTGAATTCAAGAGATTCAGCTATACACATGCTGCTTTTTTGGAAA3和5GATCCGCCAGCCATTGCTCATAGATTCAAGAGATCTATGAGCAATGGCTGGCTTTTTTGGAAA3，分別命名為siRNA1和siRNA2。兩個(gè)片段直接與經(jīng)BamH和Hind酶切的pSilencer3.1H1載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，送北京華大公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序正確的克隆分別命名為siRNA1和siRNA2。1.2 T細(xì)胞的分離

14、培養(yǎng) 取正常健康志愿者外周血5mL于肝素抗凝管中，加入RosetteSep人T細(xì)胞富集抗體混合液(50mL/L全血)，充分混勻,室溫靜置30min，以等倍體積PBS稀釋?zhuān)浞只靹蚝笮⌒募拥搅馨头蛛x液上，以20、2000r/min離心20min，取中間單核細(xì)胞層，用PBS液洗兩次(4、1500r/min 15min)，然后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×1094×109/L。1.3 潮霉素篩選濃度的確定 于6孔板中，接種T細(xì)胞3.0×105/孔，加含100mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基2mL，分別加入50g/L的潮霉素2、4、6、8、10、12L，潮霉

15、素終末質(zhì)量濃度依次為50、100、150、200、250、300mg/L，37培養(yǎng)。每3d換液1次。顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，以第8天能殺死孔內(nèi)所有T細(xì)胞的潮霉素濃度確定為篩選濃度。1.4 脂質(zhì)體介導(dǎo)的T細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24h，在6孔板內(nèi)按1×106細(xì)胞/孔接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。3周后將穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆逐次轉(zhuǎn)移至24孔板、6孔板和培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得整合有pSilencer3.1H1重組質(zhì)粒并能穩(wěn)定表達(dá)siRNA1和siRNA2的單克隆細(xì)胞株。1.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 將已轉(zhuǎn)染了siRNA1和siRNA2的單克隆細(xì)胞株制備單細(xì)胞懸液，接種96孔板，設(shè)5個(gè)復(fù)

16、孔，37、50mL/L CO2條件下培養(yǎng)。設(shè)正常人T細(xì)胞作為對(duì)照組。1、2、3、4、5、6、7d時(shí)，棄液，每孔加入20L 5mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄液，每孔加入150L DMSO，震蕩10min溶解結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔490nm的吸光度值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。1.6 RTPCR檢測(cè)TGFR的表達(dá) 根據(jù)人TGFR的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了擴(kuò)增TGFR的RTPCR引物P1和P2，以actin作為內(nèi)參照。引物由上海Sangon公司合成。actin：5CTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3，5 CTCCT

17、TAATGTCACGCACGATTTC 3，520bp，退火溫度52;TGFR：5 TTTCCACCTGTGACAACC 3，5 TGACAGATATGGCAACTC 3，346bp，退火溫度55。按照TRIZOL說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。按照RTPCR試劑盒說(shuō)明書(shū),將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再將所得的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取5L PCR反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)15g/L瓊脂糖凝膠電泳后,在紫外投射反射儀下觀察結(jié)果。采用DNA Marker作為DNA長(zhǎng)度標(biāo)志。通過(guò)凝膠圖像成像分析系統(tǒng),以目的基因的PCR擴(kuò)增片段灰度與相應(yīng)的內(nèi)參actin擴(kuò)增片段灰度的比值作為其mRNA表達(dá)水平的相對(duì)參數(shù)。1.7 Wes

18、tern blot檢測(cè)TGFR的表達(dá) 選取一抗為兔抗人TGFR多抗，二抗為生物素化山羊抗兔IgG。嚴(yán)格按照ECL Western blot試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。1.8 人牙周膜細(xì)胞的分離培養(yǎng) 選取1114歲青少年因正畸而拔除的前磨牙，用PBS液反復(fù)沖洗，無(wú)菌條件下刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪碎后用2.0×105u/L 型膠原酶37消化1h，800r/min離心5min，棄上清;用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液懸浮組織，800r/min離心5min，棄上清;加適量含100mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，連同組織塊轉(zhuǎn)至6孔板，37，950mL/L空氣、50mL/L CO2、100%濕度條件

19、下培養(yǎng)。每23d換液1次。取第58代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。免疫組化法檢測(cè)波形絲蛋白和角蛋白抗體以鑒定細(xì)胞來(lái)源。1.9 實(shí)驗(yàn)分組 將轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染靶向性TGF R基因沉默的T細(xì)胞與人牙周膜細(xì)胞置于含有1.0g/L的LPS(美國(guó)Sigma公司，按說(shuō)明書(shū)配制)和1.0mg/L黃芩苷溶液(中國(guó)藥品生物制品檢定所，精密稱取干燥至恒重的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，再將其濃度稀釋至1.0mg/L)的培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)48h。實(shí)驗(yàn)分為6組：正常牙周膜成纖維細(xì)胞+內(nèi)毒素+轉(zhuǎn)染siRNA1的T細(xì)胞+黃芩苷;正常牙周膜成纖維細(xì)胞+內(nèi)毒素+轉(zhuǎn)染siRNA1的T細(xì)胞;正常牙周膜成纖維細(xì)胞+內(nèi)毒素+

20、正常T細(xì)胞+黃芩苷;正常牙周膜成纖維細(xì)胞+內(nèi)毒素+正常T細(xì)胞;正常牙周膜成纖維細(xì)胞+黃芩苷;正常牙周膜成纖維細(xì)胞.1.10 RTPCR檢測(cè) 用TRIZOL試劑盒提取牙周膜細(xì)胞總RNA，取2.5g總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。OPG分子引物序列：上游引物5TCAAGCAGGAGTGCAATCG3，下游引物5AGAATGCCTCCTCACACAGG3，該引物將產(chǎn)生342bp的cDNA片段。RANKL分子引物序列：上游引物5GGCTCATGGTTAGATCTGGC3，下游引物5TGACCAATACTTGGTGCTTCC3，該引物將產(chǎn)生351bp的cDNA片段。actin分子引物序列：上游引物5CAATTCATGTTTGAGACCTTCAA3，下游引物5CCGGATCCATCTCTTCCTGGAAGTCCA3，該引物將產(chǎn)生362bp的cDNA片段。上述引物序列由由上海Sangon公司合成。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物15L在15g/L瓊脂糖凝膠上電泳，置于凝膠電泳成像儀，利用凝膠系統(tǒng)分析軟件Bandscan 5.0進(jìn)行半定量分析。1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)