實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究進(jìn)展

1、實(shí)時(shí)熒光定量研究進(jìn)展聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）是一種在體外擴(kuò)增特定基因序列的方法，是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)（MullisandFaloona1987），具有特異性、高效性和高度準(zhǔn)確性三大特點(diǎn)。定量PCR是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（real-timefluorescentquantitativePCR,FQ-PCR）于1996年由美國(guó)AppliedBiosystems公司推出，它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析

2、的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染性、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。1實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理與方法兩個(gè)重要概念熒光域值(threshold)：以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，一般熒光域值定義為315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。Ct值：也稱(chēng)循環(huán)閾值，C代表Cycle，t代表threshold。其含義是在PCR循環(huán)過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。在實(shí)際操作中，這個(gè)時(shí)刻也就是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域

3、值的時(shí)刻，可見(jiàn)Ct值取決于閾值。經(jīng)數(shù)學(xué)證明，Ct值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。熒光嵌合法（）的原理熒光嵌合法通常使用SYBRGREE。SYBRGREEN是一種能夠結(jié)合于所有dsRNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。它與PCR合成的雙鏈DNA結(jié)合，在激發(fā)光照射下產(chǎn)生熒光，通過(guò)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物量（如圖1-3所示）。圖1-3SYBRGREEN法原理圖Fig1-3SchematicdiagramofSYBRGREEN法該方法是使用5端帶有熒光物質(zhì)（如FAM等），3端帶有熒光淬滅物質(zhì)(如TAMRA、Eclipse、BHQ等)的TaqMan探針進(jìn)行熒光檢測(cè)的方法。當(dāng)

4、探針完整時(shí)，5端的熒光物質(zhì)受到3端淬滅物質(zhì)的制約，不能檢出熒光；而當(dāng)TaqMan探針被分解后，5端的熒光物質(zhì)便會(huì)游離出來(lái)，發(fā)出熒光（如圖1-4所示）。圖1-4TaqManProbe法原理圖Fig1-4SchematicdiagramofTaqManProbePCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。TaqMan探針?biāo)庥袃蓚€(gè)前提：第一，引物和探針都必須與模板雜交；第二，與探針特異性結(jié)合的DNA模板的到擴(kuò)增?；谶@兩點(diǎn)要求，即

5、使發(fā)生非特異性擴(kuò)增，也不會(huì)以影響檢測(cè)結(jié)果（Gelminietal.1997;Livaketal.1995;Morrisetal.1996;Swanetal.1997）。法CyclingProbe法是由RNA和DNA構(gòu)成的雜合探針與RNaseH組合使用的高靈敏度檢出法，能夠高效率地檢出擴(kuò)增過(guò)程中及擴(kuò)增結(jié)束時(shí)的目的基因片段（原理如圖1-5所示）。CyclingProbe內(nèi)部含有RNA堿基，一端標(biāo)記熒光物質(zhì)，一端標(biāo)記淬滅物質(zhì)，當(dāng)探針處于完整狀態(tài)時(shí)，由于熒光淬滅作用抑制熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，但當(dāng)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列雜交后，RNaseH在RNA部分將探針切斷，淬滅抑制作用解除，熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。通過(guò)檢

6、測(cè)反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量。圖1-5CyclingProbe法原理圖Fig1-5SchematicdiagramofCyclingProbe2TaqManProbe法探針設(shè)計(jì)原則總體原則（1）先選擇好探針，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近探針（2）所選序列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有最小二級(jí)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段測(cè)，如果不能避免二級(jí)結(jié)構(gòu)，那么就要相應(yīng)提高退火溫度（3）擴(kuò)增長(zhǎng)度應(yīng)不超過(guò)400bp，理想的最好能在100150bp內(nèi)，擴(kuò)增片段越短，有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴(kuò)增片段也容易保證分析的一致性（4）保持GC含量在20和80之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)

7、增效率的降低，以及出現(xiàn)在熒光染料分析中非特異信號(hào)（5）為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個(gè)連續(xù)的G）（6）將引物和探針互相進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成引物設(shè)計(jì)原則（1）序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段（2）避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)（3）典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量（4）Tm值在5565（因?yàn)?0核

8、酸外切酶活性最高），GC含量在4060%（5）引物之間的TM相差避免超過(guò)2（6）引物的3端避免使用堿基A，引物的3端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基（7）為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子這是因?yàn)槎?jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響反應(yīng)效率，而且還會(huì)阻礙酶的擴(kuò)增。建議先進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)檢（8）Taqman探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在50150bp（9）引物末端（最后5個(gè)核苷酸）不能有超過(guò)2個(gè)的G和C探針設(shè)計(jì)原則（1）探針位置盡可能地靠近上游引物（2）探針長(zhǎng)度應(yīng)在1545bp（最好是2030bp)，以保證結(jié)合特異性（3）檢測(cè)探針的DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu)（4）Tm值在6570，通常比引物TM值高510（至少要5），

9、GC含量在4070%（5）探針的5端應(yīng)避免使用G，因?yàn)?G會(huì)有淬滅作用，而且即使是被切割下來(lái)還會(huì)存在淬滅作用（6）整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量，G含量高會(huì)降低反應(yīng)效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針（7）為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在Blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針3定量方法在real-timeFQ-PCR中，模板定量有兩種策略：絕對(duì)定量和相對(duì)定量（Walker2001）。絕對(duì)定量一般通過(guò)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)；相對(duì)定量則是用來(lái)確定經(jīng)過(guò)不同處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時(shí)相的表達(dá)差異。比較

10、而言，絕對(duì)定量結(jié)果容易理解，標(biāo)準(zhǔn)品難以制備和控制，而相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品容易制備，數(shù)據(jù)難以理解。3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對(duì)定量法將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知樣品進(jìn)行定量時(shí)，根據(jù)未知樣品的CT值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA常作為絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備之用。標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來(lái)轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)來(lái)確定。3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法可以使用絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)操作上更為簡(jiǎn)便易行。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA

11、的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個(gè)已知濃度樣品做一系列梯度稀釋。由于在此方法中目的基因表達(dá)是相對(duì)于某個(gè)參照基因的量而言的，因此相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線就比較容易制備。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中樣本的靶序列的量來(lái)自于標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終必須除以參照物的量，即將參照物定為1，其它的樣本為參照物量的n倍。3.3CT相對(duì)定量法CT法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的不同之處在于其運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)量，前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到CT值來(lái)反應(yīng)起始模板的量，一個(gè)循環(huán)（CT=1）的不同相當(dāng)于起始模板數(shù)2倍的差異。但是此方法是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率基本一致為前提的，效率的偏

12、移將影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計(jì)。4實(shí)時(shí)熒光定量PCR在基因工程領(lǐng)域的應(yīng)用細(xì)胞因子的表達(dá)研究細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)蛋白，它通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)（包括淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化、生存和凋亡）在免疫系統(tǒng)中起著核心作用。為了闡明在許多炎癥反應(yīng)，自身免疫性疾病和器官移植排異中的免疫致病途徑，細(xì)胞因子mRNA表達(dá)譜的可靠定量是很重要的。盡管被檢樣本中細(xì)胞因子含量往往極低，然而實(shí)時(shí)熒光定量PCR以其高敏感性和準(zhǔn)確性在細(xì)胞因子的定量中越來(lái)越受到青睞?；虮磉_(dá)研究廣西醫(yī)科大學(xué)賴(lài)永榕等（2002）應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)地中海貧血癥患者與珠蛋白mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確，為了解地貧的分子病理機(jī)制及其臨床診斷提

13、供了可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)基因研究Tesson等（2002）確定了實(shí)時(shí)定量PCR的技術(shù)條件，利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)域值擴(kuò)增一個(gè)轉(zhuǎn)移后的基因和一個(gè)內(nèi)參基因，以分析轉(zhuǎn)基因鼠的接合性。該方法為45個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的同型結(jié)合及異質(zhì)接合提供了明確的鑒定結(jié)果。用Southern印跡方法檢測(cè)時(shí)，利用一內(nèi)對(duì)照和PhosphorImager定量來(lái)分析這些動(dòng)物，其中6個(gè)結(jié)果不明確，其他的與實(shí)時(shí)定量PCR方法得到的結(jié)果一致。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，同型結(jié)合和異質(zhì)接合的動(dòng)物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。這項(xiàng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中將有很大用途。單核苷酸多態(tài)性（）及突變分析實(shí)時(shí)熒光

14、定量PCR一個(gè)誘人的應(yīng)用前景是用于檢測(cè)基因突變和基因組的不穩(wěn)定性?；蛲蛔兊臋z測(cè)基于兩條探針，一條探針橫跨突變位點(diǎn)，另一條為錨定探針，與無(wú)突變位點(diǎn)的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。如靶序列中無(wú)突變，探針雜交便完全配對(duì)，如有突變，則探針與靶序列不完全配對(duì)，會(huì)降低雜交體的穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度。這樣便可對(duì)突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。Ibrahim等（1997）應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)正常的痘病毒多態(tài)性進(jìn)行了研究，結(jié)果成功地鑒定了存在此單核苷酸差異的兩個(gè)痘病毒株。實(shí)時(shí)熒光定量的優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用前景傳統(tǒng)的定量PCR技術(shù)（如倍比稀釋法、內(nèi)參照法、競(jìng)爭(zhēng)法、PCR-ELISA法）難點(diǎn)在于：（1）如

15、何確定PCR正處于線性擴(kuò)增范圍內(nèi)（只有在此范圍內(nèi)PCR產(chǎn)物信號(hào)才與初始模板的拷貝數(shù)成比例）。（2）一旦線性擴(kuò)增范圍確定以后，如何找到一個(gè)合適的方法檢測(cè)結(jié)果。為了保證線性，研究者要擴(kuò)增一系列梯度稀釋的cDNA或者對(duì)每個(gè)基因的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整；有的研究者加一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性模板，有的做限制性的稀釋梯度分析，或者加一個(gè)PCR模擬反應(yīng)，即用相似的引物與目標(biāo)產(chǎn)物共擴(kuò)增，而擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)通常在跑膠以后通過(guò)染料、放射活性或者探針進(jìn)行檢測(cè)。（3）大多數(shù)是終點(diǎn)檢測(cè)，即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而PCR經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異（圖

16、1-6），即使加入內(nèi)標(biāo)后可以部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性，也只能算作半定量或粗略定量。圖1-6熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖Fig1-6Amplificationfigureofreal-timefluorescentquantitativePCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：（1）特異性好，使用特異性探針針對(duì)定量分子進(jìn)行識(shí)別，具有很高的準(zhǔn)確性。同時(shí)，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽(yáng)性低。（2）靈敏度，熒光PCR檢測(cè)技術(shù)是綜合了PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯像技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測(cè)靈敏度很高。（3）線性關(guān)系好、線性范圍寬，由于熒光信號(hào)的產(chǎn)生和每次擴(kuò)增產(chǎn)物成一

17、一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，通過(guò)熒光信號(hào)的檢測(cè)可以直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量。（4）操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高、防污染。擴(kuò)增和檢測(cè)可以在同一管內(nèi)完成，不需要開(kāi)蓋，避免污染；同時(shí)完成擴(kuò)增和檢測(cè)，不需要后期處理。（5）速度快、高通量，可在2-3h完成96個(gè)樣品的定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR目前已經(jīng)成為不同樣品間進(jìn)行基因表達(dá)水平定量差異比較的權(quán)威方法。在過(guò)去十年之內(nèi)，該方法迅速流行，涉及農(nóng)業(yè)、環(huán)境、工業(yè)、醫(yī)學(xué)研究等諸多領(lǐng)域。但是，大量的技術(shù)缺陷可能會(huì)影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)的質(zhì)量，包括不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，沒(méi)有足夠的對(duì)照和重復(fù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和樣品操作技術(shù)缺乏適當(dāng)?shù)亩x，低質(zhì)量RNA樣品，反轉(zhuǎn)錄引物選擇不理想，反應(yīng)條件和數(shù)據(jù)分析方法的不正確等。為幫助研究者能產(chǎn)生一致的、高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)