實時熒光定量PCR研究進(jìn)展

1、實時熒光定量研究進(jìn)展聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）是一種在體外擴增特定基因序列的方法，是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)（MullisandFaloona1987），具有特異性、高效性和高度準(zhǔn)確性三大特點。定量PCR是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實時熒光定量PCR技術(shù)（real-timefluorescentquantitativePCR,FQ-PCR）于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析

2、的方法。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染性、具實時性和準(zhǔn)確性等特點，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。1實時熒光定量PCR技術(shù)原理與方法兩個重要概念熒光域值(threshold)：以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，一般熒光域值定義為315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。Ct值：也稱循環(huán)閾值，C代表Cycle，t代表threshold。其含義是在PCR循環(huán)過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。在實際操作中，這個時刻也就是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域

3、值的時刻，可見Ct值取決于閾值。經(jīng)數(shù)學(xué)證明，Ct值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。熒光嵌合法（）的原理熒光嵌合法通常使用SYBRGREE。SYBRGREEN是一種能夠結(jié)合于所有dsRNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。它與PCR合成的雙鏈DNA結(jié)合，在激發(fā)光照射下產(chǎn)生熒光，通過熒光強度的檢測，可以實時監(jiān)測PCR擴增的產(chǎn)物量（如圖1-3所示）。圖1-3SYBRGREEN法原理圖Fig1-3SchematicdiagramofSYBRGREEN法該方法是使用5端帶有熒光物質(zhì)（如FAM等），3端帶有熒光淬滅物質(zhì)(如TAMRA、Eclipse、BHQ等)的TaqMan探針進(jìn)行熒光檢測的方法。當(dāng)

4、探針完整時，5端的熒光物質(zhì)受到3端淬滅物質(zhì)的制約，不能檢出熒光；而當(dāng)TaqMan探針被分解后，5端的熒光物質(zhì)便會游離出來，發(fā)出熒光（如圖1-4所示）。圖1-4TaqManProbe法原理圖Fig1-4SchematicdiagramofTaqManProbePCR擴增時，Taq酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。TaqMan探針?biāo)庥袃蓚€前提：第一，引物和探針都必須與模板雜交；第二，與探針特異性結(jié)合的DNA模板的到擴增?；谶@兩點要求，即

5、使發(fā)生非特異性擴增，也不會以影響檢測結(jié)果（Gelminietal.1997;Livaketal.1995;Morrisetal.1996;Swanetal.1997）。法CyclingProbe法是由RNA和DNA構(gòu)成的雜合探針與RNaseH組合使用的高靈敏度檢出法，能夠高效率地檢出擴增過程中及擴增結(jié)束時的目的基因片段（原理如圖1-5所示）。CyclingProbe內(nèi)部含有RNA堿基，一端標(biāo)記熒光物質(zhì)，一端標(biāo)記淬滅物質(zhì)，當(dāng)探針處于完整狀態(tài)時，由于熒光淬滅作用抑制熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，但當(dāng)探針與擴增產(chǎn)物中的互補序列雜交后，RNaseH在RNA部分將探針切斷，淬滅抑制作用解除，熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。通過檢

6、測反應(yīng)體系中的熒光強度，能夠?qū)崟r監(jiān)控PCR擴增產(chǎn)物量。圖1-5CyclingProbe法原理圖Fig1-5SchematicdiagramofCyclingProbe2TaqManProbe法探針設(shè)計原則總體原則（1）先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近探針（2）所選序列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有最小二級結(jié)構(gòu)的擴增片段測，如果不能避免二級結(jié)構(gòu)，那么就要相應(yīng)提高退火溫度（3）擴增長度應(yīng)不超過400bp，理想的最好能在100150bp內(nèi)，擴增片段越短，有效的擴增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴增片段也容易保證分析的一致性（4）保持GC含量在20和80之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會導(dǎo)致擴

7、增效率的降低，以及出現(xiàn)在熒光染料分析中非特異信號（5）為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G）（6）將引物和探針互相進(jìn)行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成引物設(shè)計原則（1）序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段（2）避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)（3）典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量（4）Tm值在5565（因為60核

8、酸外切酶活性最高），GC含量在4060%（5）引物之間的TM相差避免超過2（6）引物的3端避免使用堿基A，引物的3端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基（7）為避免基因組的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子這是因為二級結(jié)構(gòu)會影響反應(yīng)效率，而且還會阻礙酶的擴增。建議先進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)檢（8）Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50150bp（9）引物末端（最后5個核苷酸）不能有超過2個的G和C探針設(shè)計原則（1）探針位置盡可能地靠近上游引物（2）探針長度應(yīng)在1545bp（最好是2030bp)，以保證結(jié)合特異性（3）檢測探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)（4）Tm值在6570，通常比引物TM值高510（至少要5），

9、GC含量在4070%（5）探針的5端應(yīng)避免使用G，因為5G會有淬滅作用，而且即使是被切割下來還會存在淬滅作用（6）整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量，G含量高會降低反應(yīng)效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針（7）為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在Blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針3定量方法在real-timeFQ-PCR中，模板定量有兩種策略：絕對定量和相對定量（Walker2001）。絕對定量一般通過定量標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)；相對定量則是用來確定經(jīng)過不同處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時相的表達(dá)差異。比較

10、而言，絕對定量結(jié)果容易理解，標(biāo)準(zhǔn)品難以制備和控制，而相對定量標(biāo)準(zhǔn)品容易制備，數(shù)據(jù)難以理解。3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對定量法將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測得的CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對未知樣品進(jìn)行定量時，根據(jù)未知樣品的CT值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA常作為絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備之用。標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)來確定。3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線相對定量法可以使用絕對標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對標(biāo)準(zhǔn)品在實驗操作上更為簡便易行。相對標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA

11、的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個已知濃度樣品做一系列梯度稀釋。由于在此方法中目的基因表達(dá)是相對于某個參照基因的量而言的，因此相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線就比較容易制備。在整個實驗中樣本的靶序列的量來自于標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終必須除以參照物的量，即將參照物定為1，其它的樣本為參照物量的n倍。3.3CT相對定量法CT法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的不同之處在于其運用了數(shù)學(xué)公式來計算基因表達(dá)的相對量，前提是假設(shè)每個循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到CT值來反應(yīng)起始模板的量，一個循環(huán)（CT=1）的不同相當(dāng)于起始模板數(shù)2倍的差異。但是此方法是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴增效率基本一致為前提的，效率的偏

12、移將影響實際拷貝數(shù)的估計。4實時熒光定量PCR在基因工程領(lǐng)域的應(yīng)用細(xì)胞因子的表達(dá)研究細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)蛋白，它通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)（包括淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化、生存和凋亡）在免疫系統(tǒng)中起著核心作用。為了闡明在許多炎癥反應(yīng)，自身免疫性疾病和器官移植排異中的免疫致病途徑，細(xì)胞因子mRNA表達(dá)譜的可靠定量是很重要的。盡管被檢樣本中細(xì)胞因子含量往往極低，然而實時熒光定量PCR以其高敏感性和準(zhǔn)確性在細(xì)胞因子的定量中越來越受到青睞?；虮磉_(dá)研究廣西醫(yī)科大學(xué)賴永榕等（2002）應(yīng)用實時熒光定量PCR方法對地中海貧血癥患者與珠蛋白mRNA水平進(jìn)行檢測，其結(jié)果特異性強、定量準(zhǔn)確，為了解地貧的分子病理機制及其臨床診斷提

13、供了可靠的檢測數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)基因研究Tesson等（2002）確定了實時定量PCR的技術(shù)條件，利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)域值擴增一個轉(zhuǎn)移后的基因和一個內(nèi)參基因，以分析轉(zhuǎn)基因鼠的接合性。該方法為45個轉(zhuǎn)基因動物的同型結(jié)合及異質(zhì)接合提供了明確的鑒定結(jié)果。用Southern印跡方法檢測時，利用一內(nèi)對照和PhosphorImager定量來分析這些動物，其中6個結(jié)果不明確，其他的與實時定量PCR方法得到的結(jié)果一致。通過實時定量PCR檢測，同型結(jié)合和異質(zhì)接合的動物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律。這項技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實驗中將有很大用途。單核苷酸多態(tài)性（）及突變分析實時熒光

14、定量PCR一個誘人的應(yīng)用前景是用于檢測基因突變和基因組的不穩(wěn)定性?；蛲蛔兊臋z測基于兩條探針，一條探針橫跨突變位點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對，如有突變，則探針與靶序列不完全配對，會降低雜交體的穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度。這樣便可對突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。Ibrahim等（1997）應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)對正常的痘病毒多態(tài)性進(jìn)行了研究，結(jié)果成功地鑒定了存在此單核苷酸差異的兩個痘病毒株。實時熒光定量的優(yōu)勢及應(yīng)用前景傳統(tǒng)的定量PCR技術(shù)（如倍比稀釋法、內(nèi)參照法、競爭法、PCR-ELISA法）難點在于：（1）如

15、何確定PCR正處于線性擴增范圍內(nèi)（只有在此范圍內(nèi)PCR產(chǎn)物信號才與初始模板的拷貝數(shù)成比例）。（2）一旦線性擴增范圍確定以后，如何找到一個合適的方法檢測結(jié)果。為了保證線性，研究者要擴增一系列梯度稀釋的cDNA或者對每個基因的擴增循環(huán)數(shù)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整；有的研究者加一個競爭性模板，有的做限制性的稀釋梯度分析，或者加一個PCR模擬反應(yīng)，即用相似的引物與目標(biāo)產(chǎn)物共擴增，而擴增產(chǎn)物的檢測通常在跑膠以后通過染料、放射活性或者探針進(jìn)行檢測。（3）大多數(shù)是終點檢測，即PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達(dá)平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實驗，所得結(jié)果有很大差異（圖

16、1-6），即使加入內(nèi)標(biāo)后可以部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性，也只能算作半定量或粗略定量。圖1-6熒光定量PCR擴增曲線圖Fig1-6Amplificationfigureofreal-timefluorescentquantitativePCR實時熒光定量PCR具有如下顯著優(yōu)點：（1）特異性好，使用特異性探針針對定量分子進(jìn)行識別，具有很高的準(zhǔn)確性。同時，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。（2）靈敏度，熒光PCR檢測技術(shù)是綜合了PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯像技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測靈敏度很高。（3）線性關(guān)系好、線性范圍寬，由于熒光信號的產(chǎn)生和每次擴增產(chǎn)物成一

17、一對應(yīng)的關(guān)系，通過熒光信號的檢測可以直接對產(chǎn)物進(jìn)行定量。（4）操作簡單、安全、自動化程度高、防污染。擴增和檢測可以在同一管內(nèi)完成，不需要開蓋，避免污染；同時完成擴增和檢測，不需要后期處理。（5）速度快、高通量，可在2-3h完成96個樣品的定量分析。實時熒光定量PCR目前已經(jīng)成為不同樣品間進(jìn)行基因表達(dá)水平定量差異比較的權(quán)威方法。在過去十年之內(nèi)，該方法迅速流行，涉及農(nóng)業(yè)、環(huán)境、工業(yè)、醫(yī)學(xué)研究等諸多領(lǐng)域。但是，大量的技術(shù)缺陷可能會影響實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)的質(zhì)量，包括不適當(dāng)?shù)膶嶒炘O(shè)計，沒有足夠的對照和重復(fù)，對實驗條件和樣品操作技術(shù)缺乏適當(dāng)?shù)亩x，低質(zhì)量RNA樣品，反轉(zhuǎn)錄引物選擇不理想，反應(yīng)條件和數(shù)據(jù)分析方法的不正確等。為幫助研究者能產(chǎn)生一致的、高質(zhì)量的實驗數(shù)據(jù)，定量PCR實驗數(shù)據(jù)發(fā)