基于表面等離子體共振原理的核酸檢測(cè)技術(shù)

1、基于表面等離子體共振原理的核酸檢測(cè)技術(shù)*        【摘要】     目的 建立基于表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）生物傳感器的核酸檢測(cè)技術(shù)，為實(shí)時(shí)、在線檢測(cè)航天微生物奠定技術(shù)基礎(chǔ)。方法 應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室建立的便攜式生物分子在線分析系統(tǒng)（portable online biomolecules analyzer，POBA），在傳感器表面固化探針?lè)肿?，?duì)溶液中的靶序列進(jìn)行雜交檢測(cè)，研究該檢測(cè)方法的靈敏度、特異性及可重復(fù)性等

2、。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)中建立的核酸檢測(cè)方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)靶序列的實(shí)時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)下限達(dá)2.3 nmol/L，進(jìn)行9次雜交檢測(cè)的變異系數(shù)為3.5，重復(fù)進(jìn)行30次檢測(cè)的變異系數(shù)為14.7。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)建立的核酸檢測(cè)方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，SPR傳感器技術(shù)在核酸雜交檢測(cè)工作中有著廣闊的應(yīng)用前景。     【關(guān)鍵詞】  表面等離子體共振傳感器；特異性；檢測(cè)限；重復(fù)性；穩(wěn)定性    Oligonucleotide Hybridization Detection Based on Surface Plasmo

3、n Resonance Technology.LIU Xueyong, BAI Yanqiang, WANG Chunyan, DAI Zhongquan, LI YinghuiAbstract：Objective To establish a kind of detection technique of nucleic acid based on surface plasmon resonance(SPR) and to set up the foundation of realtime, online space microbial detection. Methods A portabl

4、e online biomolecules analyzer based on SPR biosensor was applied. The probe was mercaptomodified at the 5 end and immobilized on the sensor surface. Then the target sequences in the solution were monitored and sensitivity, specificity and reproducibility of the method were investigated. Results The

5、 results showed that detection method with good specificity and sensitivity could realize online detection of target sequence. The system could detect 2.3 nmol/L target sequence, CV value of nine detections was 3.5% and that of thirty detections was 14.7%. Conclusion The established nucleic acid det

6、ection method has the advantage of high sensitivity, good specificity and reproducibility, which can be applied in the field of nucleic acid detection.Key words:surface plasmon resonance biosensor; specificity; detection limit; reproducibility; stabilityAddress reprint requests to：LI Yinghui.China A

7、stronaut Research and Training Center, Beijing 100094，China航天員在執(zhí)行空間任務(wù)的過(guò)程中，輻射及應(yīng)激等因素的綜合作用將導(dǎo)致免疫功能下降1,2，而航天器內(nèi)的溫濕環(huán)境又適宜于微生物的生長(zhǎng)繁殖3，因此航天環(huán)境中的微生物對(duì)航天員的健康及載人飛行器系統(tǒng)的可靠性4形成更大的威脅。目前航天環(huán)境的微生物檢測(cè)仍以在空間對(duì)環(huán)境進(jìn)行樣品采集，任務(wù)結(jié)束后返回地面對(duì)微生物進(jìn)行鑒定為主3，檢測(cè)過(guò)程滯后，無(wú)法對(duì)航天器內(nèi)的微生物污染及時(shí)采取相應(yīng)的處置措施，影響航天員的健康及航天任務(wù)的順利完成。如能實(shí)時(shí)、在線對(duì)航天環(huán)境的微生物進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)，對(duì)確保航天員的健康及工作效率

8、具有極其重要的意義。    目前生物傳感器技術(shù)憑借其實(shí)時(shí)、靈敏、快速的特點(diǎn)應(yīng)用廣泛，是建立空間實(shí)時(shí)微生物檢測(cè)系統(tǒng)的可選方法之一。其中，表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)作為一種無(wú)需進(jìn)行樣品標(biāo)記、能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)生物分子之間相互作用的光學(xué)檢測(cè)方法，近年來(lái)發(fā)展迅速。該方法樣品用量少，靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，在核酸雜交、遺傳病診斷、基因突變研究及微生物檢測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用以SPR生物傳感器為技術(shù)核心的便攜式生物分子在線分析系統(tǒng)（portable online biomolecules analyzer,POB

9、A），通過(guò)將巰基修飾的寡核苷酸固化于傳感器表面作為探針?lè)肿?，?duì)溶液中的靶序列進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)對(duì)該檢測(cè)方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性等進(jìn)行研究，為SPR生物傳感器技術(shù)應(yīng)用于微生物的實(shí)時(shí)、在線檢測(cè)提供依據(jù)。方法儀器  POBA系統(tǒng)構(gòu)成圖見(jiàn)文獻(xiàn)5。試劑  6巰基1己醇（6mercapto1hexanol，MCH）購(gòu)于SigmaAldrich，其余試劑購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司，實(shí)驗(yàn)中所用溶液組成如下：固化溶液，KH2PO4 1 mol/L；雜交緩沖液，NaCl 150 mmol/L，Na2HPO4 20 mmol/L，EDTA 0.1 mmol/L；再生溶液，HCl 0.5 mol/L。

10、寡核苷酸序列合成于北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。探針序列，5HST18GCTGCCTCCCGTAGGAGT3；互補(bǔ)寡核苷酸，5ACTCCTACGGGAGGCAGC3；非互補(bǔ)寡核苷酸，5GCTGCCTCCCGTAGGAGT3。核酸分子膜的制備  通過(guò)探針?lè)肿?末端的巰基與傳感器金膜形成的硫-金共價(jià)鍵，完成探針?lè)肿釉诮鹉け砻娴墓袒?）傳感器金膜放入4SDS中浸泡10 min，將棉簽浸濕后輕輕擦拭金膜表面，純凈水沖洗后晾干。2）將傳感器置于支架上，使金膜處于水平位置，吸取100 l探針溶液（1 mol/L，固化溶液配制）滴于金膜表面并使之鋪平，室溫濕盒中固化2 h，純凈水清洗后滴加100

11、l 1 mmol/L MCH（純凈水配制）于金膜表面，封閉傳感器表面的空余位點(diǎn)。核酸樣品檢測(cè)  待測(cè)序列溶液恒速流經(jīng)傳感器表面，與探針?lè)肿影l(fā)生雜交反應(yīng)，具體步驟如下：1）待測(cè)序列溶液（雜交緩沖液配制）注入檢測(cè)池5 min；2）注入雜交緩沖液3 min清洗測(cè)試面，以除去未結(jié)合的寡核苷酸分子。傳感器再生  注入0.5 mol/L HCl 30 s，使雜交雙鏈解聚，完成探針?lè)肿拥脑偕?，進(jìn)入下一個(gè)檢測(cè)循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在室溫（25 ）下進(jìn)行，溶液注入通過(guò)蠕動(dòng)泵完成，流速控制在60 l/min，所檢測(cè)到的信號(hào)，稱之為折射率（refractive index, RI），雜交反應(yīng)前后的R

12、I差值代表傳感器表面結(jié)合靶序列的量。結(jié)果應(yīng)用傳感器表面固化的探針?lè)肿?，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原理檢測(cè)溶液中的靶序列，靶序列與探針結(jié)合后表現(xiàn)為折射率值的升高，結(jié)合靶序列的質(zhì)量與折射率的變化值正相關(guān)。傳感器特異性  應(yīng)用1 mol/L非互補(bǔ)寡核苷酸溶液作為陰性對(duì)照進(jìn)行雜交，非互補(bǔ)核酸序列與傳感器表面探針無(wú)結(jié)合，引起的RI變化值可忽略（低于1.0×10-5）。傳感器檢測(cè)限  將互補(bǔ)靶序列溶液倍比稀釋，濃度分別為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 nmol/L，然后依次將樣品注入流通池進(jìn)行檢測(cè)，所得的濃度折射率曲線如圖1所示。

13、從圖2中可見(jiàn)，該曲線在062.5 nmol/L濃度范圍內(nèi)呈線性分布，計(jì)算所得的最低檢測(cè)限為2.3 nmol/L（對(duì)空白溶液進(jìn)行3次檢測(cè)，計(jì)算3次結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差，以數(shù)值的3倍為縱坐標(biāo)，曲線中所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)濃度值即為最低檢測(cè)限）。圖1  靶序列溶液與探針雜交的濃度折射率曲線。（略）Fig.1  Concentration vs refractive index curve of hybridization of a probe with a series of target sequences圖2  濃度在062.5 nmol范圍內(nèi)的靶序列與探針雜交的濃度折射率曲線（略

14、）Fig.2  Concentration vs refractive index curve of hybridization of a probe with the range of 062.5 nmol target sequence傳感器重復(fù)性與穩(wěn)定性  應(yīng)用相同濃度（1 mol/L）互補(bǔ)靶序列進(jìn)行9次檢測(cè)，所得RI結(jié)果的平均值為（10.52±0.37）×10-5，變異系數(shù)CV為3.5。為了驗(yàn)證該核酸傳感器的穩(wěn)定性，應(yīng)用相同濃度（1 mol/L）互補(bǔ)靶序列重復(fù)進(jìn)行30次檢測(cè)，將測(cè)試中靶序列與探針的雜交時(shí)間縮短為3 min，所得RI結(jié)果的平均值為(

15、7.84±1.16)×10-5，變異系數(shù)CV為14.7。討論目前SPR技術(shù)應(yīng)用于微生物檢測(cè)領(lǐng)域主要針對(duì)特異性表面抗原，易受到微生物表面抗原變異的影響；而微生物基因組16S rDNA中的保守序列較為穩(wěn)定，變異程度低，在微生物診斷及種類鑒定方面具有優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)中選用的探針是真細(xì)菌16S rDNA中的保守片段，以求應(yīng)用于下一步的微生物檢測(cè)工作。探針固化是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)中將探針的5端進(jìn)行巰基化修飾，通過(guò)該巰基與傳感器金膜形成硫金共價(jià)鍵從成固化；一種探針固化方法也將傳感器的表面預(yù)先進(jìn)行葡聚糖修飾，依次將鏈霉親和素（streptoavidin）及生物素（biotin）化的探針與

16、傳感器進(jìn)行交聯(lián)，完成探針的固化。該兩種固化方法均可獲得適宜的探針密度，雜交反應(yīng)結(jié)果理想6，但后者程序較復(fù)雜，影響因素較多，操作時(shí)間長(zhǎng)，故本實(shí)驗(yàn)中采用巰基修飾探針的固化方法，直接簡(jiǎn)便，利于控制實(shí)驗(yàn)條件。在傳感器表面進(jìn)行寡核苷酸探針的固化通常存在2種問(wèn)題：1）探針在傳感器表面呈平鋪狀態(tài)；2）互補(bǔ)靶序列在固相雜交中的空間位阻。固化過(guò)程中，探針?lè)肿渔溳^長(zhǎng)，則探針?lè)肿油ㄟ^(guò)5末端巰基固化的同時(shí)，探針鏈上的氨基也可與金膜形成微弱的化學(xué)鍵，使探針?lè)肿釉诮鹉け砻嫘纬善戒伒臓顟B(tài)，不利于靶序列與探針?lè)肿拥碾s交。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用MCH封閉金膜表面空閑位點(diǎn)，該小分子與金膜形成穩(wěn)定的硫-金共價(jià)鍵而取代探針與金膜形成的微弱化學(xué)鍵

17、，使探針?lè)肿釉诮鹉け砻娉手绷顟B(tài)而更有利于雜交反應(yīng)。探針合成過(guò)程中在巰基及探針序列間加入了18個(gè)T堿基，通過(guò)增加探針?lè)肿拥拈L(zhǎng)度，維系靶序列與探針?lè)肿与s交所必需的空間，又有效地增加了探針雜交部位與金膜表面的距離，降低了靶序列與金膜之間的空間位阻，更有利于靶序列與探針的雜交反應(yīng)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)方法分析時(shí)間短，靶序列樣品檢測(cè)可在15 min內(nèi)完成；靈敏度高，檢測(cè)下限可達(dá)2.3 nmol/L，與國(guó)外實(shí)驗(yàn)室7的10 nmol/L檢測(cè)下限有較大程度的提高；特異性強(qiáng)，與非互補(bǔ)序列雜交無(wú)折射率的變化，單堿基錯(cuò)配序列（5ACTCCTACGGGAGGCAGC3）與探針雜交，引起折射率的變化值僅為完全互補(bǔ)序列

18、與探針雜交后折射率變化值的78.6（結(jié)果未顯示），表現(xiàn)出較高的特異性。POBA系統(tǒng)通過(guò)光學(xué)信號(hào)反映傳感器表面結(jié)合分子的質(zhì)量，不受電、磁、力等因素的干擾，適用于航天特殊環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建核酸分子膜，對(duì)溶液中的待測(cè)序列進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)性好，出色地實(shí)現(xiàn)溶液中核酸的檢測(cè)，通過(guò)進(jìn)一步設(shè)計(jì)探針及對(duì)微生物進(jìn)行相應(yīng)的處理，在未來(lái)長(zhǎng)期空間任務(wù)中的微生物監(jiān)測(cè)工作中將起到舉足輕重的作用。    【參考文獻(xiàn)】  1 Taylor GR, Konstantinova I, Sonnenfeld G, et al. Changes in the immune system

19、 during and after spaceflightJ. Adv Space Biol Med, 1997, 6（2）:132.2 Taylor GR. Immune changes during shortduration missionsJ. Journal of Leukocyte Biology, 1993, 54(3):202208.3 Pierson DL. Microbial contamination of spacecraft J. Gravit Space Biol Bull, 2001,14(2):16 .4 Klintworth R, Reher HJ, Viktorov AN, et al. Biological induced corrosion of materials