總RNA的提取定量與RT-PCR

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓 名： 學(xué) 號(hào)： 專業(yè)年級(jí)： 級(jí)臨床八年制 組 別： 第二實(shí)驗(yàn)室 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)名稱(Title of Experimetn總RNA的提取、定量與RT-PCR實(shí)驗(yàn)日期(Date of Experiment11月27日實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)(Lab No.第二實(shí)驗(yàn)室合作者(Partner指導(dǎo)老師(Instructor總分(Total Score教師簽名(Signature批改日期(Date【預(yù)習(xí)報(bào)告】一、 實(shí)驗(yàn)原理1總RNA的提取與定量在哺乳動(dòng)物中，平均每個(gè)細(xì)胞內(nèi)大約含有10-5g RNA，其中rRNA占總量的80%-85%，tRNA和核內(nèi)小分子RNA占10-15%，而

2、mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等幾類組成，這些RNA分子根據(jù)密度和分子大小，通過密度梯度離心、凝膠電泳、離子交換層析進(jìn)行分離。mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一，在細(xì)胞中含量少，絕大多數(shù)mRNA分子（除血紅蛋白、有些組蛋白mRNA以外），在3端存在20-250個(gè)多聚腺苷酸(polyA。利用此特點(diǎn)，用oligo(dT親和層析柱分離mRNA。 RNA分離的方法有：異硫氰酸胍氯化銫超速離心法，鹽酸胍-有機(jī)溶劑法，氯化鋰-尿素法，蛋白酶K-細(xì)胞質(zhì)RNA提取法等、異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol試劑適用于從細(xì)胞和組織中快速分離RNA。TR

3、Izol的主要成分是異硫氰酸胍和酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中還加入了8羥基喹啉、-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA選擇性地進(jìn)入無DNA和蛋白質(zhì)的水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。 Trizol試劑可用于小量樣品（50100mg組織、5×106細(xì)胞）也適用于大量樣品（1g組織、>107細(xì)胞）。對(duì)

4、人，動(dòng)物，植物組織，細(xì)菌均適用，整個(gè)提取過程在一小時(shí)內(nèi)即可完成。分離的總RNA無蛋白質(zhì)和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA篩選，體外翻譯，RNase保護(hù)分析和分子克隆。在用于RT-PCR時(shí)如果兩條引物存在于一個(gè)單一外顯子內(nèi)，建議用無RNase的DNase處理RNA樣品，避免出現(xiàn)假陽性。共純化的DNA可用作標(biāo)準(zhǔn)，比較不同樣品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白質(zhì)可用于western blotting。 2逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR 提取組織或細(xì)胞中

5、的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。 二、 實(shí)驗(yàn)材料1總RNA 的提取1. 紫外分光光度計(jì)、微量加樣槍、滅菌超薄PCR反應(yīng)管 2. Trizol試劑 3. 氯仿 4. 異丙醇 5. 75乙醇6. 無RNase的水或0.5SDS (溶液均需用DEPC處理過的水配制 2RT-PCR1. 基因擴(kuò)增

6、儀(如PE GeneAmp PCR System 2400 或 9700、微量加樣槍、凝膠成像系統(tǒng)、滅菌超薄PCR反應(yīng)管 2RNA提取試劑 3第一鏈cDNA合成試劑盒4dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L5Taq DNA聚合酶 三、 實(shí)驗(yàn)步驟（一）總RNA的提取 1. 勻漿處理: a.組織 將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml Trizol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過Trizol體積10。 b.單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入Trizol裂解細(xì)胞，每10cm2面積加1ml，用移液器吸打幾次。Trizol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而

7、定，不取決于細(xì)胞數(shù)。Trizol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。 c.細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml Trizol，反復(fù)吸打。加Trizol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。 (注意：勻漿一定要徹底，是提取高質(zhì)量RNA的前提；細(xì)胞數(shù)量與Trizol的比例，細(xì)胞的數(shù)量不能過多。 2. 將勻漿樣品在室溫（15-30）放置5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。 3. 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8 10000×

8、;g離心10 min，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。 4. 每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3 min。 (注意：此步振蕩非常重要，建議在旋渦振蕩器上進(jìn)行。 5. 2-810000×g離心15 min。樣品分為三層：底層為黃色（紅或綠）有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用Trizol試劑的60。 6. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中（如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相），用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1m

9、l Trizol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10 min。 7. 2-810000g離心10 min，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。 8. 用75乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml 75乙醇。2-8不超過7500g離心5 min，棄上清。 9. 室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得過干，否則不易溶解，大約晾5-10min。加入25-200l無RNase的水，-70保存。 （二）RT-PCR 1. 總RNA的提?。阂娗笆鰞?nèi)容。 2. cDNA第一鏈的合成：目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一

10、?，F(xiàn)以TAKARA公司提供的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒為例。 （1）在0.2ml微量離心管中，加入以下： 總RNA 1-5 g 、dNTP 1 l 、Random primer 1 l 、補(bǔ)充適量的DEPC H2O使總體積達(dá)10 l。輕輕混勻、離心。 （2）PCR儀上65加熱5min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。 （3）然后加入下列試劑的混合物： 5×PrimeScript buffer 4 l 、RNase inhibator 0.5 l 、RTase 1 l 、RNase free H2O 4.5 l

11、，輕輕混勻，離心. （4） 30孵育10 min。 （5） 42孵育60 min。 （6）于70加熱15 min以終止反應(yīng)，將管插入冰中。 3PCR：本次實(shí)驗(yàn)采用Premix Taq Version2.0(Loading dye mix試劑 （1）取0.5ml PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 l 、上游引物（10pmol/L）2 l 、下游引物（10pmol/L）2 l 、dNTP(2mmol/L 4 l 、10×PCR buffer 5 l 、Taq酶（2U/l） 1 l 。（2）加入適量的ddH2O，使總體積達(dá)50 l。輕輕混勻，離心。 （3）設(shè)定PCR程序。在適

12、當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴(kuò)增28-32個(gè)循環(huán)。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，可在PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，加入一對(duì)內(nèi)參（如G-3-PD）的特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參DNA，作為對(duì)照。 （4）電泳鑒定：進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。 （5）結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)電泳條帶掃描分析。 四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1、本實(shí)驗(yàn)大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染。 2、快速的操作，低溫環(huán)境，少量取上清 主要是抽提之后吸取上清時(shí)要特別小心，只要不把蛋白層吸出來就不會(huì)有RNase污染。3、加樣原則是酶最后加，其他試劑按照體積大小從大往小的加?！緦?shí)驗(yàn)記錄】一、 實(shí)驗(yàn)條件見第一、第二部分。二、 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象1、 瓊脂糖凝膠電泳圖像：反轉(zhuǎn)錄DNA條帶MARKER帶從凝膠電泳的圖像上看，本組的反轉(zhuǎn)錄DNA條帶可以看到與MARKER帶對(duì)應(yīng)的特異性條帶，但特異性不明顯，也出現(xiàn)了彌散或非特異性條帶?！窘Y(jié)果與討論】一、結(jié)果如上圖所示。三、 討論（1）特異性反轉(zhuǎn)錄DNA條帶不明顯