多參數(shù)流式細胞術分析415例成人和兒童B-ALL白血病相關免疫表型(精)

1、多參數(shù)流式細胞術分析 415 例成人和兒童 B-ALL 白 血病相關免疫表型作者：劉艷榮，陳珊珊， 常艷， 付家瑜， 張樂萍，王卉， 李玲娣，主鴻鵠， 劉桂蘭，陸道培， 黃曉軍【摘要】為了探討FCM在微量殘留病(MRD檢測中的意義，利用4-6組4色抗體組合，以CD45/SSC設門法對273例成人和142例兒童B系急性淋 巴細胞白血病(B-ALL)患者進行了多參數(shù)流式細胞術(FCM免疫分型檢測和 白血病相關免疫表型( leukemia associated immunophenotyping, LAIP )分 析。結果表明：根據(jù)CD34和CD10的表達特點，可將B-ALL患者分為I型(CD34

2、CD10- ;型( CD34 CD10)；m型(CD34-CD10);W型(CD34- CD10-)。I型和n型患者LAIP的陽性比例分別為100唏口 92%但m型患者 LAIP陽性率只有79.2%,顯著低于I型和n型患者。總體 B-ALL患者LAIP的檢 出率為90%成人與兒童組無明顯差異。而利用CD34/CD10/CD19/CD4一組抗體，LAIP檢出率達到77.6%。結論：90%成人和兒童B-ALL白血病患者具有 LAIP,因此對這類患者適宜用多參數(shù)流式細胞術進行MRD監(jiān)測?！娟P鍵詞】急性B系白血病；白血病相關免疫表型；多參數(shù)流式細胞Leukemia-Associated Immunop

3、henotypes in 415Childhood and Adult Patients with B Lineage AcuteLymphoblastic Leukemia by Multiparametric Flow Cytometry Analysis AbstractTo evaluate the significance of FCM in minimal residual disease(MRD)detection,the immunophenotyping and leukemia-associated immunophenotypes (LAIP)of leukemia ce

4、lls from 273 adult and 142 childhood patients with B lineage acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) were detected by four to six antibody combinations of 4-color CD45/SSC gating multiparametric flow cytometry (FCM). The results showed that the B-ALL patients could be classified into 4 subtypes based o

5、n different expression CD34 and CD10 : subtypeI(CD34 /CD10-),subtypen( CD34 /CD10 ) , subtypem( CD34-/CD10 ) , subtypeIV(CD34-/CD10-). The LAIP was observed in 100% and 92% patients of subtype I and subtype n , respectively, whereas only 79.2% in subtype m. The incidence of LAIP in total B-ALL cases

6、 was 90% byusing the antibodies detected in this investigation. There was no significantce different for incidence of LAIP between adult and pediatric patients. LAIP was observed in 77.6% of patients by labeling only CD34/CD10/CD19/CD45 4-color antibody combination. It is concluded that in 90% of ch

7、ildhood and adult B-ALL patients LAIP can be found, which suits MRD detection by multiparameter flow cytometry.Key wordsacute B lineage leukemia； leukemia-associated immunophenotyp es； multi parametric flow cytometryB 細胞型急性淋巴細胞白血病(B-ALL)免疫亞型的MIC診斷標準自1985年起一直沿用至今， 并且被新的WHO分類標準所采用。該標準根據(jù)胞漿免疫球蛋白(cIg )和細

8、胞核 內(nèi)抗原TdT及表面免疫球蛋白(sIg )、HLA-DRffi CD10將B-ALL分為：early-precursors-B-ALL, commom-B-ALL, pre-B-ALL 和 B-ALL4 亞型。用流式 細胞儀檢測胞漿抗原的表達，操作較煩瑣，有一定難度，且結果不穩(wěn)定，因此 其在臨床的常規(guī)檢測中應用受到限制。 1997年 Jennings 等 1提出將 BALL 分為：B-precursor-ALL, pre-B-ALL和 B-ALL3亞型，又將 B-precursor-ALL,分為CD10和CD10兩類。該系統(tǒng)在 MIC基礎上加入CD34 CD20 CD22 CD24 CD9

9、抗原。近幾年多參數(shù)流式細胞術（FCM的開發(fā)和應用促進了對正常 B 細胞分化階段抗原表達的認識，但是否可通過簡便的抗原檢測而達到對 B-ALL 進行亞型的分型，本研究對此進行了初步探討。雖然B-ALL患者的白血病細胞在抗原表達類型和出現(xiàn)的順序與正常 B祖細胞基本相似，但白血病細胞具有一 些正常細胞不存在或存在比例較低的抗原表達特點，可作為辨認白血病細胞的 標志，文獻上對其稱為白血病相關免疫表型（ leukemia associated immunophenotypes，LAIP ） 2。利用 FCM通過檢測 LAIP 可對 B-ALL 微量殘 留病（MRD進行監(jiān)測，這一方法已成為與聚合酶鏈反應（

10、PCR并用的檢測 MRD勺主要方法。目前國際上對 B-ALL-MRD勺檢測結果多來自兒童患者，而且 主要的研究對象為前體 B-ALL （precursor ）。而成人B-ALL患者在免疫表型尤 其是LAIP與兒童患者是否存在區(qū)別？ FCM-MR的檢測是否同樣適合于成人B- ALL患者？及兒童和成人不同亞型 B-ALL患者中LAIP的陽性率是否相同？均不 十分清楚。本室在掌握了正常 B祖細胞免疫表型的基礎上3，對415例成人 和兒童B-ALL患者的上述問題進行了研究，以探討其在 MRD檢測中的意義。 材料和方法 研究對象 2000年 8 月至 2005年 6月在我室進行免疫分 型檢測的 B-AL

11、L 患者共 415 例，其中初治 409 例，復發(fā) 6 例。成人（年齡大于 14 歲）組 273例，中位年齡 32歲（ 15-82 歲），男 160 例，女 113 例。兒童組 142例，中位年齡9歲（2-14歲），男89例，女53例。B-ALL患者的免疫分型檢測 取肝素抗凝的骨髓或外周血標本，利用我室設計的 4 色熒光CD7、CD2、CD38-FITC 為 公司）。經(jīng)流 ） 測定時將正常（4種熒光素分別為：FITC、PE APC PerCF）直接免疫標記法進行 B-ALL的 免疫分型檢測，以 CD45/SSC（ side scatter ，側向散射）設門，故每管均加 CD45-PerCP抗體

12、。主要標記4-6管4色抗體組合，檢測的抗原分別為 CD19 CD10 CD34 CD20， CD22， HLA-DR CD13 CD33 CD14 CD5 CD38 CD117 CD11I（ CD13-FITC 為美國 An cell 公司產(chǎn)品， PharMingen 公司產(chǎn)品，其余抗體均購自美國 Becton Drckinson 式細胞儀 （FACSort 型， Becton Dickinson 公司，裝備雙激光管 淋巴細胞的CD45熒光值調到103左右。每份標本獲取10 000個細胞。分析時 以幼稚細胞群中抗原表達細胞 20%作為陽性。由于在儀器設定時將正常淋巴細 胞的CD45熒光值調到1

13、03左右，此時正常B系祖細胞的CD45全部101,因此 CD45抗原以90%田胞101定為CD45陽性（CD45 ），90%田胞101定為CD45 陰性（CD45-），90%細胞101 到102定為 CD45弱陽性（CD4±）。B-ALL免 疫分型的診斷標準參考文獻 4。統(tǒng)計學處理 采用成對樣本 t 檢驗和卡方檢驗。結果B-ALL免疫分型本組B-ALL患者中，CD19全部陽性。由于正常B細胞的不同分化階段CD34和CD10表達具有明顯的階段性，并且白血病細胞基本保留此 特性，因此我們參考MIC分類標準，并主要根據(jù)CD34和CD10的表達，將B- ALL患者共分為4亞型（表1）: I型

14、:CD34 /CD10-，相當于MIC分類Early- Precursor-B-ALL（Pre-pre-B- ALL）; n 型:CD34 /CD10 ,相當于普通 B-ALL（c- B-ALL）;川型:CD34-/CD10，相當于前 B-ALL （Pre-B-ALL） ;型:CD34-/CD10-,相當于B-ALL?？傮wB-ALL中，以n型患者最多，占 63.1%,m型和I 型分別為18.4%和14.5%;W型最少，占3.8%。成人和兒童組比較，兒童組中 I型患者顯著低于成人組（P=0.02）。其它各型比例在兒童與成人和與總體相 比均無顯著性差異（表 1 ）。 Table 1. Freque

15、ncy of immunophenotypic subtypes in adult and child patients with B-ALL（略）B-ALL患者LAIP分析 通過與正常B祖細胞進行比較2, 在總體B-ALL中LAIP的主要表現(xiàn)為：抗原表達異常，以 CD45表達異常減弱 （ underexpression ），缺如最為多見，在總體 B-ALL 患者中占 38.6%。而且在4 個亞型中均可見到，這說明完全喪失了分化階段的特性。其它抗原表達異常 包括 CD19 CD10 CD34異常高表達（overexpressed 或 strong positive）和異常低表達（un dere

16、x pressed 或dim p ositive ）;非同步抗原表達，如n 型、m型和W型B-ALL患者的白血病細胞，在正常 CD19 B系細胞相應發(fā)育階段 除 CD34和 CD10抗原外，CD22、CD38和 CD20表達應為 CD22 CD38 CD20- CD22 CD38 CD20 /-和 CD22 CD38-CD20 ;但白血病細胞可出現(xiàn) CD34 CD20、 CD34-CD10-CD20- CD34-CD10-CD22- CD34 CD38- CD10 CD38非同步抗原表 達異常；交叉系列抗原表達，如同時表達髓系和T系標志（表2和3）。通過本研究所檢測的抗體，415例B-ALL患

17、者中373例（89.9%）患者具有可供 MRDk測的LAIP,其中利用CD10/CD34/CD19/ CD45-組抗體，LAIP的檢出率 達到 77.6%。 Table 2. Incidence of LAIP in 415 adult and child patients with B-ALL （略）Note: st -strong positive.B-ALL 各亞型中白血病相關的免疫表型分析本研究所檢測的主要抗原的異常表達在各亞型中的比例見表 3和表4。CD45和CD38異常弱表達和CD34 CD19和CD10 的強表達主要見于n型患者，使n型患者總體LAIP陽性率達92.4%。CD33

18、和CD56的異常表達以I型患者多見，且正常 CD19 B祖細胞基本不存在 CD34 CD10-表型，此型患者全部為LAIP，即均可通過免疫表型檢測 MRDm型患者 由于CD34陰性，CD10表達也已經(jīng)減弱，只有 CD20全部陰性占56.4%,高于I型 和兒型（PV0.05）,但其他標志異常率也較低，其總 LAIP率只有79.2%，比I 和n型低，但只與I型相比有統(tǒng)計學差異（P=0.000）。對W型患者，由于其 CD34和 CD10均為陰性，因此失去了 2個非常有意義的標志，LAIP陽性率最 低。與其它3型比均有統(tǒng)計學差異（P=0.001）。但我們發(fā)現(xiàn)6/7例患者CD20 為陰性，而此期的正常B

19、細胞，CD20應強陽性，因此通過CD20的檢測可能利 于W型患者MRD勺監(jiān)測。雖然表4顯示W(wǎng)型患者LAIP陽性率為56.2%,但LAIP 陰性的7名患者均未檢測CD22和CD20因此，如果每位W型患者均檢測此兩 種抗體，則實際 LAIP 陽性率可能會大大增加。 Table 3. Frequency of LAIP positive patients in subtype of B-ALL （略）成人和兒童組 B-ALL 患者白血病相關的免疫表型分析表4顯示成人和兒童組B-ALL患者白血病相關的免疫表型陽性比例，兒童組中 LAIP 陽性率為 90.1%，成人組為 89.7%, 兩者 無統(tǒng)計學差異

20、。而兒童和成人 B-ALL各亞型之間及與總體之間均無顯著差異。 這一結果說明FCM同樣適合于成人B-ALL患者MRD勺監(jiān)測。Table 4.Percentage of LAIP positive patients in subtype of B-ALL（略） 討論近幾年，由于多參數(shù)FCM的建立和應用，我們對正常 B細胞分化階段抗原表達有了新的認識。文獻報道和我們的結果均說明利用CD34/CD10/CD19/CD4可將正常B細胞從最早期到成熟期進行分型。而 1985年 提出的MIC標準所依據(jù)的抗原中CD19和 HLA-DR在 B細胞分化全程表達，而對B-ALL來講，HLA-DR不是一個特異性的標

21、志，因此在診斷 B-ALL進行時可不必 檢測此抗原。TdT和CD1（的表達在正常B祖細胞不同分化階段具有明顯的階段 性，而文獻報道5和我們的結果證明，正常 B祖細胞中CD34與 TdT的表達 具有一致性。雖然文獻報道Pre-B-ALL TdT為陽性,而相應的同期正常B祖細胞 CD34和TdT應為陰性，但Jennings等1與我們的結果，均顯示 pre-B-ALL 中CD34為陰性。這說明TdT在B-ALL中的表達喪失了分化階段特異性，因此利 用CD34抗原作為亞型的分型標志優(yōu)于 TdT。cIg和sIg是很好的抗原標志，不 足之處是 cIg 的標記操作較繁瑣，同時標記 cIg 和 sIg 也增加

22、檢測費用。我們 檢測了 B祖細胞中cIg和sIg的表達，結果與文獻報道相同7，cIg表達見 于CD34-CD10階段，屬于CD19 B系分化的第n期，sIg表達見于CD34- CD10dim階段，屬于B系分化的第m期,因此我們主要依據(jù)CD34和CD10勺表達 將B-ALL患者分為4種亞型。對I型B-ALL，我們的結果說明在正常 CD19 B祖 細胞中無明顯的CD34 CD10細胞，而近幾年多參數(shù)FCM僉測的文章中也未證明 存在此群細胞，但有文獻報道存在 TdT CD10 CD19和CD34 CD10 CD19早期幼 稚細胞5,6 。因此CD34 CD10-CD19®胞是否屬于B細胞分

23、化的最早期階 段，尚無定論。但B系ALL患者中，有14沁者CD34陽性而CD10陰性，且與 MIC分型中early Precursors-B-ALL 相似，故將其定為I型。 MIC分型中的c- B-ALL，指CD10陽性但cIg和sIg均陰性的患者，實際上與 CD34 CD10發(fā)育階 段一致。m型與MIC分型中的Pre-B-ALL相同。我們未系統(tǒng)檢測B-ALL中CD34 的TdT關系，但文獻報道，Pre-B-ALL患者TdT /-?，F(xiàn)在看來，CD34 TdT-應屬 于LAIP的一種。本組兒童B-ALL的分類結果與1993年前依據(jù)MIC標準進行分 型的大宗標本的結果8基本一致。但當時對成人 B-

24、ALL患者的亞型分類中， 由于缺乏 cIg 的資料，因此成人中 Pre-B-ALL 的比例不詳。這說明成人 B-ALL 中cIg的檢測并不普遍，影響了成人 B-ALL的亞型分型。本研究利用CD34/CD10/CD19/CD4抗體組合，不僅可對 B-ALL進行分型，又彌補了 MIC中 的不足，還可用于LAIP檢測和MRD隨訪。目前對CD22抗原表達的認識已有更 新。 Lucio 9 （1999）、McKenna5 （2001）和我們的結果均證明，在 B 系祖細胞分化發(fā)育的早期，即表達 CD22且CD20主要為陰性，因此CD34 CD22 CD20-是 I期B祖細胞的正常表型，并非 LAIP。而2

25、002年發(fā)表的 WH白血病和 淋巴瘤的新分類標準中10，還認為早期的B祖細胞為CD22陰性。1999年 前發(fā)表的文章中，有將 CD34和CD22同時陽性和CD34 CD22 CD20歸于LAIP1。現(xiàn)在分析，這些應為正常表型。造成如此大差異的主要原因是CD22抗體所連接的熒光素不同，如 CD22-FITC,該熒光素的熒光強度較弱。相似的原 因可能造成不同的文獻某些抗原表達的差異，如髓系標志的表達。而FITC和PE標記的CD20的表達基本是一致的。FCM主要通過檢測LAIP來鑒別白血病細 胞。對B-ALL患者，文獻報道LAIP主要有4種表現(xiàn)11-13 :非同步抗原 同時表達，如CD34和胞漿卩鏈

26、同時陽性；交叉系列抗原表達，如 B-ALL細 胞同時表達髓系和T系標志；抗原表達量異常,如CD10 CD34 CD19過強表達 和CD38 CD45等表達缺失及低表達；光散射信號改變,包括側向光散射、前向 光散射。本研究結果中，LAIP主要表現(xiàn)為抗原表達量的異常，以 CD45弱表達 或表達缺失最為常見，其它抗原異常依次為CD19 CD38 CD10 CD34交叉系列抗原：髓系或T系表達占24%而CD56表達率達到21%非同步抗原同時表 達主要見于CD20與 CD38。而光散射信號改變在發(fā)病時表現(xiàn)較明顯，但在 MRD 的檢測中，難以利用此標志進行鑒別【參考文獻】 1 Jennings CD, F

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