再生障礙性貧血患者骨髓腎素血管緊張素系統(tǒng)表達的研究

1、再生障礙性貧血患者骨髓腎素血管緊張素系統(tǒng)表達的研究               作者：彭敏源，趙謝蘭，高欣，雷瑚儀 【摘要】  腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAS）已被證明參與了骨髓造血細胞的生長增殖和分化，而再生障礙性貧血（AA）被認為是與骨髓造血細胞受損和造血微環(huán)境缺陷有關的疾病。為了探討AA的發(fā)病機制，運用放射免疫方法檢測22例AA患者骨髓和外周血腎素活性及Ang、Ang濃度，并以16例外周血常規(guī)和骨髓檢查正常的患者為對照組，比較兩組之間的差異。結

2、果發(fā)現(xiàn)： AA組骨髓Ang濃度低于對照組（P<0.01），AA組的骨髓Ang濃度與外周血比較差異無統(tǒng)計學意義（P0.05），對照組的骨髓Ang濃度較同組的外周血高（P<0.01），兩組的腎素活性及Ang濃度差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論： AA患者骨髓Ang濃度降低，AA發(fā)病可能與其有關。 【關鍵詞】  再生障礙性貧血Renin Angiotensin System in Bone Marrow of  Patients with Aplastic AnemiaAbstract    Renin-angiotensin

3、 system (RAS) has been shown to be involved in the growth，production，proliferation and differentiation of the bone marrow (BM) hematopoietic cells，while aplastic anemia (AA) is a disease in which proliferation ability of the BM hematopoietic cells is damaged with defective hematopoietic microenviron

4、ment. To investigated the pathogenesis of AA，the rennin activity，angiotensin(Ang) and angiotensin (Ang) concentration in peripheral  blood and BM of  22 AA patients were detected by radioimmunnoassay，16  nonhematological disease patients with nomal blood counts and BM  picture we

5、re used as control，and the differeence between two groups was compared.  The results showed that  BM Angconcentration in the AA patients was significantly lower than that in the control （P<0.01）. In nonhematological disease patients，Angconcentration  in BM  was significantly h

6、igher than that in peripheral blood，the  renin activities and Angconcentrations were  not  significantly different in the two groups（P>0.05）.  In conclusion，the decreased BM Angconcentration in AA   patients may be involved to  the pathogenesis of AA.Key words&#

7、160;   aplastic anemia; rennin angiotensin system; Ang；  Ang;  bone marrow hematopoietic cell    腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)被認為是調(diào)節(jié)血壓電解質(zhì)的內(nèi)分泌系統(tǒng)，然而近年發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)在許多組織中（心臟、血管、腎臟和消化系統(tǒng)）存在旁分泌和自分泌，并參與組織器官的損傷修復。1996年Haznedaroglu等1首次提出骨髓中也存在RAS，并認為該系統(tǒng)在病理和生理條件下對骨髓（BM）造血

8、、造血細胞的生成和增殖分化可能產(chǎn)生作用。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素(Ang)能夠促進放射線損傷后小鼠骨髓造血功能的恢復2，增強人類臍血CD34+CD38-細胞集落形成的增殖能力3。應用免疫組織化學方法也發(fā)現(xiàn)，骨髓細胞胞漿內(nèi)和胞膜上有血管緊張素轉化酶（ACE）的表達4。再生障礙性貧血(AA)被認為與造血干細胞損傷、造血微環(huán)境功能缺陷有關，但是其確切的發(fā)病機制未明，因此研究AA患者骨髓RAS的變化，有助于了解RAS在骨髓造血中及在AA發(fā)生機制上的作用。材料和方法對象選取2004年7月-2005年3月在中南大學湘雅醫(yī)院確診為再生障礙性貧血的患者22例(AA組)，男10例，女12例，年齡15-63歲

9、。 AA患者均為初治病例，22例中急性再生障礙性貧血8例，慢性再生障礙性貧血14例，均符合診斷標準5。外周血和骨髓均正常的非血液病患者16例（對照組），其中因肌營養(yǎng)不良健康體檢患者6例，頭昏乏力要求健康體檢者10例，男6例，女10例，年齡12-55歲。所有患者均須排除以下情況： 排除高血壓、糖尿病、心力衰竭、嚴重的肝肺腎病等與RAS有關的疾病，無浮腫脫水；排除服用ACEI（血管緊張素轉化酶抑制劑）、ARB（血管緊張素受體拮抗劑）類藥或停用1周以內(nèi)的患者，服用可能影響RAS的藥物（如兩性霉素B，受體阻滯劑）的患者；排除嚴重感染、重要臟器出血；排除低增生性MDS、低增生性白血病、純紅細胞AA和急性

10、AA危象。標本的收集兩組病人均在骨髓穿刺前當天行血常規(guī)檢查，并在穿刺前休息10分鐘以排除緊張情緒，骨髓穿刺部位除1例再生障礙性貧血為胸骨外，其余均為髂后上棘。常規(guī)骨髓涂片后立即抽取骨髓液2 ml，注入預先加有0.3  mol/L EDTA 40 l、8-羥喹啉 20 l、2-巰基丙醇10 l的聚乙烯塑料試管中，輕微搖勻。同時取患者肘靜脈血2 ml，注入預先加有0.3 mol/L EDTA 20 l、8-羥喹啉20 l、2-巰基丙醇10 l的聚乙烯塑料試管中，輕微搖勻。4冰箱靜置2小時，然后500×g離心10分鐘。分別取上清移入聚乙烯塑料試管并標記，置-20冰箱保存。每月檢測

11、1次。骨髓和外周血標本均為臥位下獲取。RAS的檢測用放射免疫分析法檢測腎素活性和Ang、 Ang濃度，操作嚴格按試劑盒說明書(試劑盒由北京北方生物技術研究所提供)進行。批內(nèi)變異系數(shù)（CV）<10%，批間變異系數(shù)（CV）<15%，所有樣本均在湘雅醫(yī)院內(nèi)分泌實驗室測定。骨髓增生程度判斷骨髓增生程度依據(jù)骨髓中有核細胞的量來確定，采用5級評定法。級：極度活躍（有核細胞成熟紅細胞為10.5-2.0）；級：明顯活躍（有核細胞成熟紅細胞為15-12）；級：活躍（有核細胞1成熟紅細胞為116-32）；級：減低（有核細胞成熟紅細胞為135-70）；級：重度減低（有核細胞成熟紅細胞為1300）。統(tǒng)計學

12、處理所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件分析。外周全血數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，方差齊，采用單因素方差分析。其他數(shù)據(jù)均為非正態(tài)分布，方差不齊，采用秩轉換的非參素檢驗。骨髓增生度比較為單向有序列聯(lián)表資料，采用秩和檢驗。骨髓和外周血RAS比較：組內(nèi)比較采用配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗，組間比較采用兩個獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結 果一般情況比較兩組研究對象的年齡、性別等一般狀況差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。對照組外周血細胞計數(shù)與AA組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。骨髓增生程度的比較AA組患者

13、骨髓細胞學檢查均為增生減低或重度減低，對照組均為增生活躍或明顯活躍。兩組骨髓增生度比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（表1）。Table 1.   Bone marrow proliferation degree analysis of the patients with aplastic anemia (AA) and control（略）骨髓和外周血RAS比較AA組骨髓和外周血中腎素活性、Ang和Ang濃度無明顯差異(P>0.05)。對照組骨髓和外周血中腎素活性、Ang濃度無明顯差異(P>0.05)，而骨髓Ang濃度明顯高于外周血 (P<0.

14、01)。AA組骨髓Ang水平明顯低于對照組(P<0.01)。骨髓腎素活性、Ang水平兩組間無明顯差異（P>0.05）。外周血腎素活性、Ang和Ang水平兩組間無明顯差異（P>0.05）（表2）。Table 2.  Peripheral blood and Bone marrow RAS analysis in aplastic anemia patients（略）    由于骨髓抽取物是骨髓和血液的混合物，因此骨髓腎素活性、Ang和Ang濃度可考慮是骨髓和外周血來源的總合，用骨髓腎素活性、Ang和Ang濃度減去外周血相應指標可能更好的代

15、表骨髓源的腎素活性、Ang和Ang水平，這樣可以縮小循環(huán)RAS對骨髓的影響。所以我們同時計算骨髓源腎素活性、Ang和Ang濃度。計算公式如下：骨髓源腎素活性=骨髓腎素活性-外周血腎素活性；骨髓源Ang濃度=骨髓Ang檢測濃度-外周血Ang檢測濃度；骨髓源Ang濃度=骨髓Ang檢測濃度-外周血Ang檢測濃度6。經(jīng)過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，AA組骨髓源Ang水平較對照組明顯降低（P<0.01），而骨髓源Ang水平、腎素活性在兩組中比較無顯著差異（P>0.05）（表3）。Table 3.  RAS gradients analysis of bone marrow in aplastic

16、 anemia patients（略）百事通 討論近年來大量研究資料顯示，局部存在的RAS 參與了骨髓的造血過程，并在生理和病理過程中扮演重要角色。本研究的目的是要通過檢測腎素活性、Ang和Ang水平在骨髓和外周血中的區(qū)別來證明RAS的存在和在AA發(fā)病中的角色。    我們的研究結果顯示，再生障礙性貧血組骨髓源Ang及骨髓源Ang濃度較對照組明顯降低。這提示AA患者骨髓微環(huán)境中存在缺陷，并推斷骨髓Ang濃度降低可能是AA的發(fā)病機制中的重要因素。已知Ang是RAS系統(tǒng)中最重要的生理代謝產(chǎn)物之一，通過與其受體AT1、AT2結合對造血干/祖細胞、紅系、粒系的增殖和發(fā)育起

17、調(diào)節(jié)作用2，3，7。應用RT-PCR技術已證明，不僅在人類基質(zhì)細胞克隆、T淋巴細胞、B淋巴細胞上，而且CD34+CD38+、CD34+CD38-細胞上都有AT1a表達3，并且通過NF-B，JAK -STAT，MAKP等細胞內(nèi)信號轉導途徑參與基因的轉錄調(diào)節(jié)，促進細胞的增殖和發(fā)育 8-10。Ang不僅可通過旁分泌/自分泌方式直接激活造血干/祖細胞的AT1，而且還可能通過刺激骨髓間質(zhì)細胞合成生長因子，進而發(fā)揮其促增殖效應3。故而我們推斷AA患者骨髓中Ang水平的降低可能使造血干/祖細胞的增殖潛力低下，形成外周全血細胞減少。近年來發(fā)現(xiàn)，Ang還有促血管新生作用，主要通過促進VEGF受體基因的表達11。

18、VEGF是目前已知最強的血管生成因子，因而Ang在血管新生及腫瘤血管形成中都有重要的作用。國內(nèi)王俊賢等12研究發(fā)現(xiàn)，AA患者骨髓中微血管受損，微血管數(shù)量減少，并認為通過促進AA患者骨髓中微血管增生，使骨髓血供改善，從而誘導造血組織增生，這可能會為AA的治療開辟一條新的道路。因此，AA骨髓中Ang水平下降是否導致VEGF生成不足，使骨髓微血管生成減少，最終導致AA患者骨髓微血管數(shù)量減少，造血組織供血供養(yǎng)不足，致使AA發(fā)生，還有待證實。此外AA患者全血細胞減少，全身組織器官均供血供氧不足，骨髓內(nèi)Ang濃度下降，使血管舒張，在一定程度上對造血組織缺血缺氧有緩解作用。綜上所述，AA骨髓中Ang濃度降低

19、可能從多方面多機制影響到AA的發(fā)生。臨床上若能找到提高AA病人骨髓局部Ang濃度的辦法就有可能找到有效治療AA的新途徑。    本次實驗還發(fā)現(xiàn)腎素活性、Ang在每組骨髓與外周血及組間比較沒有差別，與有關報道一致6，13。這提示骨髓局部是否存在腎素的旁分泌/自分泌還有待深入研究。    總之，AA是一組高度異質(zhì)性疾病，本實驗為我們從造血微環(huán)境角度理解AA的發(fā)生機制提供了一條新的重要線索，也為今后從造血微環(huán)境入手治療AA提供了新的可能途徑。致謝： 本實驗得到湘雅醫(yī)院血液科骨髓室全體工作人員和內(nèi)分泌科實驗室李江實驗員的技術支持，在此深表感謝

20、?！緟⒖嘉墨I】  1Haznedaroglu IC，Tuncer S，Gursoy M. A local renin-angiotensin system in the bone marrow. Med Hypotheses，1996； 46:507-5102Rodgers KE，Xiong S，diZerega GS，et al. Accelerated recovery from irradiation injury by angiotensin peptides. Cancer Chemother Pharmacol，2002; 49:403-4113Rodgers KE，Xi

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