再生障礙性貧血患者的T淋巴細(xì)胞研究進(jìn)展

1、    再生障礙性貧血患者的T淋巴細(xì)胞研究進(jìn)展        再生障礙性貧血(再障)是骨髓造血功能衰竭導(dǎo)致全血細(xì)胞減少的疾病。大量研究結(jié)果表明，再障患者骨髓造血功能衰竭的發(fā)生、發(fā)展與免疫機(jī)制，特別是T 淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能的異常密切相關(guān)1,2。我們就再障患者T淋巴細(xì)胞的研究進(jìn)展作一綜述。 1再障患者T淋巴細(xì)胞數(shù)量及亞群的變化再障患者外周血淋巴細(xì)胞的比例相對增高，他們的骨髓造血組織被脂肪組織或其它非造血細(xì)胞所代替, 淋巴細(xì)胞在骨髓穿刺液中所占的比例明顯增高。再障患者骨髓活檢標(biāo)本中

2、CD3+淋巴細(xì)胞亦明顯增多3。再障患者CD8+T淋巴細(xì)胞所占的比例增加,CD4+T淋巴細(xì)胞的比例減少,CD4+/CD8+比值降低。Viale等4用有限稀釋法對重型再障(SAA)患者骨髓和外周血的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行了集落培養(yǎng),結(jié)果表明SAA患者骨髓和外周血的CD8+T淋巴細(xì)胞集落明顯高于正常人。Maciejewski等5研究表明再障患者 TCR+-T淋巴細(xì)胞高于對照組。2再障患者T淋巴細(xì)胞功能的變化2.1再障患者T淋巴細(xì)胞處于激活狀態(tài):近年來,激活的T淋巴細(xì)胞的變化及其與再障發(fā)病的關(guān)系受到普遍重視。Maciejewski等5發(fā)現(xiàn)再障患者骨髓和外周血中HLA-DR+CD8+T淋巴細(xì)胞較正常及骨髓增生異

3、常綜合征(MDS)患者明顯增高,而接受免疫抑制治療的SAA患者恢復(fù)期HLA-DR+CD8+T淋巴細(xì)胞下降。再障患者骨髓與外周血中T淋巴細(xì)胞的變化并不完全一致，部分再障患者僅在骨髓中檢測到HLA-DR+CD8+T淋巴細(xì)胞。因骨髓穿刺液中難免有外周血混入,故用這種標(biāo)本所作的研究不能完全反映骨髓局部T淋巴細(xì)胞的改變。最近Melenhorst等3用定量免疫組化方法分析了再障患者骨髓活檢標(biāo)本,6例患者中5例骨髓活檢標(biāo)本的造血?dú)埩魠^(qū)中CD3+T淋巴細(xì)胞顯著高于對照,而且CD4+與CD8+細(xì)胞均增高,比值接近1。為分析T淋巴細(xì)胞的活化狀態(tài),他們還檢測了顆粒酶B-7(GB-7),結(jié)果發(fā)現(xiàn)GB-7+細(xì)胞顯著增高

4、,提示該組再障患者中T淋巴細(xì)胞處于活化狀態(tài)。這種T淋巴細(xì)胞選擇性定位于靶器官或局部活化增殖的證據(jù)進(jìn)一步確立了T淋巴細(xì)胞在再障發(fā)病中的重要地位。再障患者骨髓內(nèi)活化狀態(tài)的T 淋巴細(xì)胞的增加可能是再障免疫病理機(jī)制的生物學(xué)基礎(chǔ)。2.2再障患者T淋巴細(xì)胞分泌功能:T淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,既有造血刺激因子,又有造血負(fù)調(diào)控因子,以維持正常的造血活動。再障患者由于T淋巴細(xì)胞亞群及功能的變化,淋巴因子的分泌失調(diào),可產(chǎn)生過量的造血負(fù)調(diào)控因子,從而表現(xiàn)出明顯的造血抑制活性。再障患者的血清及單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素2(IL-2)水平升高,且部分患者單個(gè)核細(xì)胞可自發(fā)產(chǎn)生IL-2。用外源性rhIL-2能夠抑制

5、紅系爆式集落(BFU-E)的生長,說明IL-2的異常與再障的造血抑制有關(guān)。有人通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組人-干擾素(rhIFN-)對BFU-E、紅系祖細(xì)胞集落(CFU-E)和粒-巨噬細(xì)胞集落(CFU-GM)的生長起抑制作用,且為濃度依賴性抑制。再障患者骨髓內(nèi)的T淋巴細(xì)胞不經(jīng)預(yù)先刺激即可自發(fā)產(chǎn)生IFN-、IL-2、腫瘤壞死因子(TNF-)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-1等造血負(fù)調(diào)控因子。外周血T細(xì)胞必須經(jīng)綿羊紅細(xì)胞刺激后才能釋放細(xì)胞因子,而正常人的T淋巴細(xì)胞需要更強(qiáng)的致絲裂原的刺激下才能釋放細(xì)胞因子6。 再障患者的T淋巴細(xì)胞經(jīng)植物血凝素(PHA)刺激后較正常人T淋巴細(xì)胞更易產(chǎn)生上述因子。Nistico

6、等7研究了25例再障患者及39例其他血液系統(tǒng)疾病患者和20份正常對照的骨髓及外周血IFN-基因表達(dá)的情況,發(fā)現(xiàn)18例SAA中14例骨髓標(biāo)本中可檢測到IFN- mRNA的表達(dá),無論是健康對照及其它慢性貧血需經(jīng)常輸血者或化療后全血細(xì)胞減少或MDS患者骨髓中均無IFN- mRNA的表達(dá)。Nakao等8研究發(fā)現(xiàn)再障患者不經(jīng)體外刺激的骨髓IFN-基因表達(dá)對預(yù)示環(huán)孢霉素A(CsA)治療反應(yīng)好有一定意義。上述研究結(jié)果提示骨髓局部高濃度抑制性細(xì)胞因子與再障的發(fā)病有關(guān) 。3再障患者T淋巴細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)3.1再障患者HLA型別特征:T淋巴細(xì)胞識別抗原肽是主要組織相容性抗原復(fù)合物(MHC)限制性的。已證實(shí)HLA-

7、DR2與多種自體免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)。對再障患者HLA的研究發(fā)現(xiàn)再障患者中HLA-DR2的陽性率明顯高于正常人群9，提示HLA-DR2與再障密切相關(guān)。HLA-DR2陽性患者,對免疫抑制治療療效好10。Nakao等11用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)分析了26例CsA治療有效再障患者(其中13例為CsA依賴者)的HLA-類抗原DRB1、DQA1及DQB1等位基因的型別, 發(fā)現(xiàn)13例CsA依賴者具有共同的HLA-類單體型DRB1.1501-DQA1.0102-DQB1.0602 。PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析顯示了其第2外顯子無核苷酸序列多態(tài)性,而非CsA依賴

8、者則無一例具有上述血清學(xué)型別及DNA分型之別。這表明部分HLA-DR亞型對CsA 療效有預(yù)測作用。這些發(fā)現(xiàn)提示與CsA療效有關(guān)聯(lián)的T淋巴細(xì)胞異?？赡芘c遺傳特性(再障易感性)相關(guān)。3.2再障患者T淋巴細(xì)胞受體(TCR)的表達(dá)狀態(tài):有學(xué)者提出如果T 淋巴細(xì)胞能特異識別并破壞或抑制造血細(xì)胞,則應(yīng)在其靶器官骨髓中觀察到T淋巴細(xì)胞對某一抗原反應(yīng)的克隆性增生。Manz等12用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法研究了再障患者骨髓及外周血TCR 鏈上的可變區(qū)(TCRBV)V 1V 24轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)后發(fā)現(xiàn),盡管V 表達(dá)的異質(zhì)性高,但其中V 3、V 20、V 21及V 22亞家族在再障患者中的表達(dá)與正常對照比

9、較,至少增加3倍以上。另有學(xué)者用同樣方法擴(kuò)增骨髓T淋巴細(xì)胞TCRBV后行SSCP分析也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果13。這些結(jié)果從分子生物學(xué)方面提示免疫介導(dǎo)的再障患者有特異的、針對某些特定抗原的寡克隆T淋巴細(xì)胞的增殖。3.3再障患者T淋巴細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特征:既然部分免疫介導(dǎo)的再障患者的某些T淋巴細(xì)胞能特異識別骨髓中造血干/祖細(xì)胞并破壞或抑制它們的生長, 如能分離這些T淋巴細(xì)胞并穩(wěn)定傳代,就能利用它們鑒別出引起骨髓衰竭的靶抗原。Moebius等14從1例再障患者的外周血淋巴細(xì)胞克隆出一株CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞。它對EB病毒轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞具有殺傷作用,且這種殺傷作用能被CD3單抗和MHC-DP單抗所阻

10、斷。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一淋巴細(xì)胞株通過直接的細(xì)胞介導(dǎo)機(jī)制能抑制自體骨髓造血祖細(xì)胞的分化。這說明對MHC-DP特異的CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞克隆可能與某些再障的骨髓衰竭有關(guān)。Nakao等15從1例CsA依賴的復(fù)發(fā)再障患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中建立了29個(gè)T淋巴細(xì)胞株,其中部分CD4+T淋巴細(xì)胞株與自身富集的CD34+細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出良好的增殖性能,增殖性能最強(qiáng)的T淋巴細(xì)胞為V17(SN17)。SN17能產(chǎn)生IFN-，且與自身富集的CD34+細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)能抑制CFU-GM、BFU-E的形成,抑制率達(dá)60，但并不清楚此抑制作用是否由特殊的HLA等位基因介導(dǎo)的免疫反應(yīng)所致。最近Nakao等16又從另1例

11、CsA依賴的未曾接受輸血的再障患者(其HLA-DRB1等位基因包括1501*和0405*)骨髓單個(gè)核細(xì)胞中分離到16個(gè)CD4+細(xì)胞株。經(jīng)PCR擴(kuò)增TCRBV后SSCP分析，其中有3 個(gè)V 21+的細(xì)胞株具有相同的特性,提示這些細(xì)胞株的起源相同,命名為NT4.2。對這些細(xì)胞株的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其表型為CD3+、CD4+、CD8-、CD56+。NT4.2細(xì)胞株體外表現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性,能直接攻擊自體CD34+細(xì)胞,并能裂解EB病毒轉(zhuǎn)化的自體淋巴細(xì)胞株(LCL)、具有相同的HLA-DRB1*0405的PHA刺激的淋巴細(xì)胞及異體CD34+細(xì)胞。NT4.2細(xì)胞株還能強(qiáng)烈地抑制自體及異基因HLA-DRB1*

12、0405 CD34+細(xì)胞的集落形成。上述作用可被抗HLA-DR單抗及抗CD3單抗阻斷,提示它的細(xì)胞毒作用具有 MHC限制性及HLA-DR依賴性,該淋巴細(xì)胞是通過識別造血細(xì)胞上HLA-DR4提呈的肽片段而殺傷造血細(xì)胞。這進(jìn)一步支持了部分再障患者T 淋巴細(xì)胞可能被某一抗原激活后增殖, 并識別具有該抗原表達(dá)的造血細(xì)胞而發(fā)生的自體免疫反應(yīng)導(dǎo)致骨髓衰竭。3.4再障患者T淋巴細(xì)胞的凋亡狀態(tài):激活的T 淋巴細(xì)胞死亡對調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)起極為重要的作用,激活的T淋巴細(xì)胞可在多種情況下發(fā)生凋亡。T淋巴細(xì)胞有一種特殊的凋亡形式，稱為激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(activation induced cell death,AICD

13、),即當(dāng)T淋巴細(xì)胞的表面分子TCR/CD3被激活后,若其再次受到刺激時(shí),便發(fā)生AICD。AICD主要通過Fas抗原與其配體Fas-L參與免疫反應(yīng)過程中淋巴細(xì)胞數(shù)量的調(diào)控17,淋巴細(xì)胞被抗原激活后也開始表達(dá)Fas-L。而Fas在成熟T淋巴細(xì)胞中就有基礎(chǔ)表達(dá),在激活的T淋巴細(xì)胞表達(dá)增加。Fas和Fas-L的同時(shí)表達(dá)使激活的T淋巴細(xì)胞在其發(fā)揮功能后立即凋亡,從而避免對機(jī)體的損傷。再障患者體內(nèi)激活的T淋巴細(xì)胞增多是否與T淋巴細(xì)胞未能及時(shí)而有效地凋亡有關(guān),目前還不清楚。最近Genestier等18研究發(fā)現(xiàn),抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)可增加激活的T淋巴細(xì)胞上Fas-L的表達(dá),并通過Fas/Fas-L誘導(dǎo)激

14、活的淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡。4再障患者T淋巴細(xì)胞對體外骨髓細(xì)胞培養(yǎng)的影響早期的實(shí)驗(yàn)中即發(fā)現(xiàn)將再障患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)其集落形成數(shù)顯著減少,去除了骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的T淋巴細(xì)胞后集落形成數(shù)明顯增加。當(dāng)用再障患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞與正常人骨髓細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí),集落形成數(shù)亦顯著減少,提示再障患者的T淋巴細(xì)胞對正常人的骨髓造血祖細(xì)胞的集落產(chǎn)率有抑制作用。在再障患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液中加入抗IFN-抗體,集落形成數(shù)增加。有人觀察到再障患者外周血T淋巴細(xì)胞與正常骨髓造血細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)能抑制CFU-E的生長,而正常人T淋巴細(xì)胞則無此抑制作用19。這些事實(shí)說明,T淋巴細(xì)胞可通過直接作用或由其分泌的細(xì)胞因子

15、而抑制骨髓細(xì)胞的生長。5再障患者T淋巴細(xì)胞與造血細(xì)胞凋亡的關(guān)系再障患者的骨髓涂片和活檢形態(tài)學(xué)均表現(xiàn)為造血細(xì)胞減少。有人用流式細(xì)胞儀檢測再障患者CD34+細(xì)胞的變化,亦發(fā)現(xiàn)再障患者骨髓內(nèi)CD34+細(xì)胞數(shù)較正常顯著減少20。Maciejewski等21測定了41例再障患者與40名正常人細(xì)胞Fas受體的表達(dá),結(jié)果再障組CD34+細(xì)胞的Fas抗原(CD95)表達(dá)明顯高于正常對照組。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,再障患者T淋巴細(xì)胞高分泌TNF-和IFN-等,而TNF-或IFN-可誘導(dǎo)正常人骨髓CD34+細(xì)胞Fas表達(dá)的增高。再障患者體內(nèi)高水平的IFN-及TNF-也可誘導(dǎo)其CD34+細(xì)胞上Fas抗原的表達(dá)增加。Fas

16、基因產(chǎn)物是一種膜蛋白,也是一種受體,伸向胞漿的部分有一段與TNF受體相似,屬TNF受體家族成員。Fas的配體Fas-L是型膜蛋白,屬TNF家族成員,當(dāng)Fas-L與Fas結(jié)合時(shí),Fas可向細(xì)胞內(nèi)傳遞“死亡信號”,致細(xì)胞發(fā)生凋亡,CD34+細(xì)胞暴露于以上造血負(fù)調(diào)控因子后,可檢測到與凋亡有關(guān)的DNA降解片段22?？傊?再障骨髓衰竭的發(fā)生可能與T淋巴細(xì)胞高分泌TNF和IFN等因子,進(jìn)而上調(diào)Fas及Fas-L途徑的凋亡有關(guān)。新近Nishii等23報(bào)道了用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)及大劑量紅細(xì)胞生成素(Epo)治療1例老年再障患者獲得成功,體外試驗(yàn)顯示大劑量Epo可阻止該患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞發(fā)生凋亡。

17、6臨床療效及動物試驗(yàn)6.1抗T淋巴細(xì)胞治療再障有效:ATG/抗淋巴細(xì)胞球蛋白(ALG)是用人的胸腺細(xì)胞/淋巴細(xì)胞免疫動物后獲得的免疫球蛋白復(fù)合物,它們對T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性及調(diào)節(jié)作用可導(dǎo)致短時(shí)期內(nèi)淋巴細(xì)胞減少,它們單用于治療再障,能使約50的患者康復(fù)。CsA是一種更為特異的免疫抑制劑,它對淋巴細(xì)胞不是通過細(xì)胞毒作用,而是抑制淋巴細(xì)胞的功能,包括淋巴因子的產(chǎn)生及淋巴細(xì)胞的增殖, 它能使ATG難治的再障患者中約50的患者康復(fù)。聯(lián)合應(yīng)用ATG/ALG、CsA和造血細(xì)胞生長因子(HGF)則使療效提高到80以上,現(xiàn)已被認(rèn)為是SAA的標(biāo)準(zhǔn)治療方案,療效可與骨髓移植相媲美24,25。6.2再障動物模型的建立

18、:Kang等26把CBA/J小鼠經(jīng)采用137Cs 6Gy進(jìn)行全身照射后,再輸入取自C3H/He小鼠的胸腺及淋巴結(jié)混合細(xì)胞(LNC),誘導(dǎo)出小鼠的再障模型,且發(fā)現(xiàn)如果去除LNC中的T淋巴細(xì)胞,小鼠發(fā)生再障的可能性顯著減少,去除LNC中的B細(xì)胞或單核細(xì)胞,對小鼠發(fā)生再障并無影響。這進(jìn)一步證實(shí)了T淋巴細(xì)胞與再障發(fā)生有關(guān)。7小結(jié)綜上所述,T淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能的異常及其所造成細(xì)胞因子的分泌失調(diào)與再障發(fā)病密切相關(guān)。深入研究再障患者T淋巴細(xì)胞的異常表現(xiàn)、機(jī)制及成因?qū)ο到y(tǒng)闡明再障免疫病理機(jī)制并進(jìn)而指導(dǎo)治療具有重要意義。作者單位:和虹邵宗鴻300020天津,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液學(xué)研究所、血液病醫(yī)

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