從半合成抗體庫克隆抗TNF-α人單鏈抗體

1、    從半合成抗體庫克隆抗TNF-人單鏈抗體        摘要通過噬菌體抗體庫技術(shù)，不經(jīng)免疫克隆抗TNF-人單鏈抗體，用固相化的人重組TNF-抗原對半合成噬菌體抗體庫進行了4輪“吸附-洗脫-擴增”的篩選，可見到明顯富集，從第3輪和第4輪洗脫下來的克隆中獲得兩株可特異結(jié)合TNF-的克隆，其可變區(qū)分別屬于VH1、VH3和V1亞群。關(guān)鍵詞 噬菌體抗體庫TNF-人單鏈抗體中號 R371-33 CLONING OF HUMAN ScFv AGAINST TNF- FROM A SE

2、MI-SYNTHETIC PHAGE ANTIBODY LIBRARYWang Yan，Liu Qunying，Hua Bing，Chen Yuping，Zhu Yingchun，Chen Xiaosui（Navy General Hospital， Beijing 100037）Abstract Anti-TNF- antibody has potential uses as a therapeutic reagentA human semi-synthetic phage antibody library was used to clone anti-TNF ScFvs by-passin

3、g immunizationDuring the four rounds of panning against TNF- the enrichment of the eluted phage particles was observedScreening of the clones obtained after the third and fourth round panning yielded two clones that could bind to TNF- specificallyKey words Phage antibody library， TNF-， Human ScFv噬菌體

4、抗體庫技術(shù)的發(fā)展使單克隆抗體的制備發(fā)生了根本改觀，尤其通過該技術(shù)可不經(jīng)免疫制備抗體1，促進了人單抗技術(shù)的發(fā)展。本文報道用半合成抗體庫嘗試不經(jīng)免疫克隆抗TNF-的人單鏈抗體。1材料和方法1.1實驗材料半合成噬菌體抗體庫來自英國MRC中心，在Griffiths的Fab半合成噬菌體抗體庫2的基礎(chǔ)上改建成為單鏈抗體（ScFv）半合成噬菌體抗體庫。人重組TNF-為軍科院沈倍奮教授所贈。9E10單抗為本室保存，HRP-抗M13購自Pharmacia， HRP-羊抗小鼠IgG購自Sigma。大腸桿菌TG-1及輔助病毒VCSM13為本室保存，無琥珀抑制子的大腸桿菌菌株HB2151來自英國MRC中心。用于檢測S

5、cFv基因完整性的PCR引物為：5引物CAGTCCATATGAAATACCTATTGCCTAC；3引物TCATTCAGATCTTCTTCTGAGATGAGTT。它們分別與ScFv基因兩側(cè)的序列互補。1.2抗體庫的篩選重組TNF-以005 molL碳酸鹽緩沖液（pH9.5）稀釋到50gml，取1ml包被Immunetube（丹麥NUNC公司），4°C過夜，次日以3BSA封閉后加入1ml噬菌體抗體庫液（約1013cfu），37°C孵育2h后以005 Tween 20-PBS洗滌20次，加入1ml 01molL三乙胺室溫10min進行洗脫，然后加入05ml 1molL pH74

6、Tris-HCl中和，取075ml感染10ml新鮮培養(yǎng)的TG1菌，37°C30min，取少許鋪盤測定回收率，其余細(xì)菌全部鋪于含1葡萄糖的Amp-2TY瓊脂盤，30°C培養(yǎng)過夜，次日將盤上菌落刮下取1100接種50ml Amp-2TY中，生長至A60005時加入輔助病毒，30°C培養(yǎng)過夜，次日收集上清制備次級庫進行下一輪篩選。1.3噬菌體抗體的制備挑取單個含有噬菌體抗體表達載體的TG1菌落，接種到2ml Amp-2TY中，37°C培養(yǎng)過夜，吸取30l過夜菌液轉(zhuǎn)種到2ml Amp-2TY中，37°C培養(yǎng)1h后加入30l輔助病毒，30°C培

7、養(yǎng)過夜，離心收取上清。1.4可溶性ScFv的制備用含有噬菌體抗體的上清感染新鮮培養(yǎng)的HB2151，輔Amp-2TY盤，37°C培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落，接種到2mlAmp-2TY中，培養(yǎng)至A60003左右時加IPTG至1mmolL，30°C培養(yǎng)過夜，離心收取上清。1.5ELISA測定噬菌體抗體：TNF-以1gml包被ELISA板，50l孔，1BSA封閉后加入經(jīng)等量1BSA稀釋的待測噬菌體抗體液，孵育洗滌后以HRP-抗M13著染，OPD底物顯色，測A490。檢測ScFv：同上包被ELISA板，1BSA封閉后加入待測上清，孵育洗滌后加入9E10單抗，再孵育洗滌后以HRP-羊抗鼠I

8、gG著染，OPD底物顯色，測定A490。1.6DNA指紋測定選用適當(dāng)?shù)?和3端引物擴增待測的ScFv基因，將所擴增的約700bp的DNA經(jīng)電泳及電洗脫純化后以識別4個堿基的限制性內(nèi)切酶Hae消化，用4聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，比較其帶型以推測其是否為相同的基因。1.7DNA序列測定使用GIBCO-BRL公司雙鏈DNA循環(huán)測序系統(tǒng)或Pharmacia的T7測序套盒，按產(chǎn)品說明書操作測定DNA序列。2結(jié)果2.1半合成抗體庫的篩選將半合成抗體庫對固相化的TNF-進行了4輪“吸附-洗脫-擴增”篩選，測定每輪吸附前抗體庫滴度和洗脫回收的滴度，計算回收率，發(fā)現(xiàn)回收率逐輪增高，顯示噬菌體抗體的富集（見表1）。

9、表 1篩選過程中噬菌體抗體的富集及與Ag結(jié)合的測定Tab 1Enrichment of phage antibodies and binding to Ag during panningRound of panningImput（cfu）Elute（cfu）YieldBinding to TNF（A490）11.5×10134.4×1062.9×1071.00±0.0224.9×10133.4×1076.9×1071.05±0.0332.9×10138.0×1082.9×1051.21

10、±0.0741.2×10134.4×1083.7×1051.68±0.03：A490 for original library was 0.34±003， for helper phage was 008±001將原庫和每輪洗脫回收后擴增的庫用ELISA檢測與TNF-的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)A值呈上升趨勢（見表1），提示特異性富集。2.2所獲克隆鑒定挑取第3輪和第4輪所獲單克隆集落制備噬菌體抗體進行如下方面檢測：共選取了145個克隆，先用ELISA測定其與TNF-的結(jié)合，共得到61個陽性克?。辉儆肏BsAg、人IgG、胃蛋白酶等無關(guān)的抗

11、原檢查其特異性，有29個克隆特異性結(jié)合TNF-；然后用單鏈抗體基因3端和5端的引物通過PCR法檢測是否含有完整的ScFv基因，發(fā)現(xiàn)有24個克隆含有完整的ScFv基因，而有5個克隆僅含有一個V基因；進一步用HB2151菌株表達可溶性ScFv，檢測其與TNF-的結(jié)合，有10個克隆不能表達可與TNF-結(jié)合的可溶性ScFv；最后檢測DNA指紋發(fā)現(xiàn)最后篩出的14個克隆只有2種DNA指紋譜，提示只獲得了2個可特異結(jié)合TNF-的ScFv基因。表2為最終所獲2個克隆與不同抗原的ELISA結(jié)果。1為用Hae消化的DNA指紋分析的一個例。可見第1、4、5、6、9、10、11和14道形一樣，第2、3、8道一樣。表

12、2所獲2個克隆與不同抗原的ELISA結(jié)果Tab 2ELISA results of the two selected clones against different AgsTNF-HBsAgPepsinHuIgGClone 1065±0.020.04±0.010.10±0.010.07±0.01Clone 20.88±0.030.13±0.010.04±0.010.08±0.02Control0.06±0.010.08±0.010.04±0.010.07±0.01Contr

13、ol：Helper phages1DNA指紋分析示Fig 1Examples of DNA finger printing2.3DNA序列測定將所獲2個可特異性結(jié)合TNF-的克隆進行DNA測定（見2），發(fā)現(xiàn)克隆1的VH屬VH3亞群，與人生殖細(xì)胞基因組中VH基因段DP-32有98.6的同源性3，其CDR3有6個氨基酸殘基，VL為鏈，屬VI亞群，與基因組中V基因段DPL3序列完全相同4，其CDR3有11個氨基酸?？寺?的VH屬VH5亞群，與生殖細(xì)胞基因組中VH基因段DP-73有98.6的同源性3，CDR3有8個氨基酸，V也是鏈，與克隆1的V序列相同，但CDR3有10個氨基酸，其中前7個氨基酸也與克

14、隆1相同。2所獲2個克隆的DNA及氨基酸序列Fig 2DNA and deduced amino acid sequences of the two selected clones Underlined are CDRs3討論TNF-是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)，在許多疾病的病理過程中起著重要作用，因此抗TNF-的抗體對多種疾病可有治療效果，如：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎5、感染及創(chuàng)傷引起的休克6、炎癥性腸病7等等。但獲得可用于人體的抗TNF-人單抗存在著一定難度，噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展使不經(jīng)免疫制備抗體成為可能，無疑也為制備抗TNF-人單抗提供了一個可能途徑，如何有效地繞過免疫用基因工程手段有效地制備人單抗現(xiàn)仍在

15、不斷摸索完善之中。半合成抗體庫是這一技術(shù)中最主要的方法，我們在本研究中成功地克隆出抗TNF-人ScFv，提示這樣方法的可行性。在對半合成抗體庫的篩選過程中我們發(fā)現(xiàn)所獲克隆中有非特異結(jié)合傾向的克隆較多，而且在這些克隆中大部分只含有一個V基因，可能因缺少另一個V基因，不能組合成Fv而暴露出疏水面增加了“粘性”有關(guān)。因此在后來的篩選鑒定過程中，我們先用PCR直接從菌落鑒定有完整ScFv的克隆，再用ELISA檢測其結(jié)合活性，可簡化操作程序。在可結(jié)合TNF-的噬菌體抗體克隆中，當(dāng)進行可溶性表達后，有一部分喪失了與TNF-結(jié)合的活性，其可能原因是有些克隆不能進行有效的可溶性表達，或有些克隆親和力較低，當(dāng)在

16、噬菌體表面表達時因可能存在的多價顯示而產(chǎn)生的“螯合”效應(yīng)及HPR-抗M13的較強的信號放大作用才能測出，關(guān)于這一點國外也有類似的報道8。經(jīng)過多種分析鑒定最后得到2株抗TNF-的克隆，對其基因進行序列分析發(fā)現(xiàn)它們VH基因不同而VL同為DPL3 V基因，2個輕鏈基因的序列僅在CDR3有34個氨基酸的差異，克隆1的CDR3較克隆2多一個氨基酸，此序列差異恰是人工引入CDR3的隨機化序列部位2。本研究證實利用半合成抗體庫可繞過免疫制備TNF-抗體，但還需進一步分析鑒定，并可能需通過體外親和力成熟過程改善其性能。* 國家863計劃（863-102-09-02-01）和國家自然科學(xué)基金（39670679）

17、資助項目作者簡介第一作者：男，53歲，碩士，教授作者單位：解放軍海軍總醫(yī)院 北京  100037參考文獻1Winter G，Griffith AD，Hawkins RE，et alMaking antibodies by phage display technology Annu Rev Immunol，1994，12：4332Griffiths AD，Williams SC，Hartley O，et alIsolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoiresEMBO

18、J，1994，13：32453Tomlinson IM，Walter G，Marks JD，et alThe repertoire of human germline VH segments reveals about fifty groups of VH segments with diferent hypervariable loopsJ Mol Biol，1992，277：7764Williams SC，Winter GCloning and sequencing of human immunoglobulin V gene segmentsEur J Immunol，1993，23：145