Autotaxin多克隆抗體的制備

1、Autotaxin多克隆抗體的制備         11-01-30 10:12:00     編輯：studa20                    作者：李頌, 姜望舒, 邱洋, 張俊杰【摘要】  目的: 表達(dá)和純化帶多聚組氨酸（6×His）標(biāo)簽的Au

2、totaxin（58157位氨基酸）融合蛋白, 制備抗Autotaxin的多克隆抗體。方法: 構(gòu)建pET21cAutotaxin(58157)重組表達(dá)質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌, IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá), 經(jīng)鎳離子金屬螯合樹脂純化后, 用純化的蛋白免疫家兔, 制備抗Autotaxin的多克隆抗體。ELISA檢測(cè)抗體效價(jià), Western blot檢測(cè)抗體特異性, 并用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果: 在大腸桿菌中高表達(dá)Autotaxin(58157)His6融合蛋白, 經(jīng)親和純化后免疫家兔, 獲得了特異性的抗Autotaxin抗血清。結(jié)論: 成功構(gòu)建pET21cAutotaxin(58157)表達(dá)質(zhì)粒,

3、 原核表達(dá)獲得高純度的目的蛋白, 制備出高效價(jià)的特異性抗Autotaxin多克隆抗體。 【關(guān)鍵詞】  Autotaxin; 原核表達(dá); 多克隆抗體Autotaxin（ATX）是一個(gè)分泌型糖蛋白, 具有5核苷磷酸二酯酶（phosphodiesterase,  PDE）活性, 是胞外焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ectonucleotide pyrophosphate/phosphodiesterase,  ENPPs）家族的一員1。 ATX還具有溶血磷脂酶D（lysoPLD）活性, 能夠以溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidycholine,  LPC）為

4、底物催化生成溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,  LPA）2。通過對(duì)ATX缺失雜合體小鼠和野生型小鼠的比較發(fā)現(xiàn), ATX缺失雜合體小鼠血清中LPA的含量和ATX的活性均為野生型小鼠的一半。這一結(jié)果從整體上進(jìn)一步表明ATX是體內(nèi)催化產(chǎn)生LPA的重要物質(zhì)3。LPA作為一種能夠與Edg家族G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合的脂類信號(hào)分子, 與腫瘤關(guān)系密切。它可以促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、 分化、 調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用, 抑制細(xì)胞死亡, 提高細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、 侵染性, 并促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子4。    ATX在很多腫瘤細(xì)胞中都有高表達(dá), 在腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展過程中有著重

5、要作用, 被認(rèn)為是腫瘤治療中一個(gè)可能的靶位5。此外, ATX在神經(jīng)系統(tǒng)6、 免疫系統(tǒng)7中也發(fā)揮重要作用。以往研究結(jié)果表明, ATX可以作為一些腫瘤的診斷、 預(yù)后標(biāo)記。例如, 有研究發(fā)現(xiàn)ATX可以作為眼色素層黑素瘤患者預(yù)后狀況的判斷指標(biāo)8;  ATX含量在術(shù)后前列腺癌患者體內(nèi)下降, 它可能成為前列腺癌的預(yù)后指標(biāo)9。最近有研究發(fā)現(xiàn)在慢性丙肝患者的血清中ATX表達(dá)量顯著上調(diào), 認(rèn)為ATX可能在肝癌的發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用10?；贏TX在腫瘤發(fā)生、 發(fā)展中的重要作用, 對(duì)其表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究和抑制劑的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)。制備高效價(jià)、 高特異性的抗Autotaxin多抗將有助于與Autotaxi

6、n相關(guān)的理論和應(yīng)用研究。1  材料和方法1.1  材料  pET21c原核表達(dá)載體、 BL21大腸桿菌菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3由ATCC購買。SKOV3培養(yǎng)于含有100 U/mL青霉素（Invitrogen）、 100 U/mL鏈霉素（Invitrogen）, 2 mmol/L的L谷氨酰胺（Invitrogen）, 100 mL/L胎牛血清（Hyclone）的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco）中。培養(yǎng)于含50 mL/L CO2,  37的恒溫培養(yǎng)箱中（Thermo）。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購自Merck公司;  T

7、RIzol購自Invitrogen公司; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司; 限制性內(nèi)切酶、 Taq DNA聚合酶、 T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司; NiNTA Resins購自Novagen公司; BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。羊抗兔辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗體購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.2  方法21cAutotaxin(58157)原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建  從高表達(dá)Autotaxin的人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中抽提細(xì)胞總RNA, 用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。PCR擴(kuò)增Autotaxin蛋白58157位氨基酸對(duì)應(yīng)的cDNA。PCR

8、引物由上海生工生物技術(shù)公司合成, 序列如下: 上游引物5GGAATTCATATGTCTTGCAAGGGCAGGTGC3, 下游引物5CCGCTCGAGGCATTCTGCGGCCTTTATTTC3。PCR擴(kuò)增條件為: 94預(yù)變性5 min; 94變性30 s, 58退火30 s, 72延伸40 s（30個(gè)循環(huán)）; 72 10 min。 選用Nde I、 Xho I酶切位點(diǎn), 將PCR產(chǎn)物克隆入pET21c質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌菌株。157)His6融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化  將含有pET21cAutotaxin(58157)質(zhì)粒的E.coli BL21菌株接種于LB培養(yǎng)液中, 培

9、養(yǎng)至A600大約為0.6左右, 加入IPTG至終濃度0.2 mmol/L誘導(dǎo)4 h。 6 000 r/min離心收集菌體。用裂解緩沖液（300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液, 10 mmol/L咪唑, pH8.0）重懸, 冰上超聲破碎菌體, 12 000 r/min離心30 min, 收集上清。上清與NiNTA Resins混合, 經(jīng)漂洗緩沖液（300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液, 20 mmol/L咪唑, pH8.0）洗滌, 洗脫緩沖液（300 mmol/L NaCl, 250 mmol/L磷酸鹽緩沖液, 50 mmol/L咪唑, p

10、H8.0）洗脫收集蛋白。純化得到的蛋白經(jīng)PBS 4透析過夜, BCA法定量。157)His6融合蛋白與弗氏完全佐劑等量乳化后, 對(duì)家兔進(jìn)行免疫。免疫6次后采集抗血清。2  結(jié)果2.1  Autotaxin 58157位氨基酸對(duì)應(yīng)的cDNA的PCR擴(kuò)增和克隆  從高表達(dá)Autotaxin的SKOV3細(xì)胞系中抽提總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄獲得出的cDNA。以cDNA為模板, PCR擴(kuò)增Autotaxin蛋白58157位氨基酸對(duì)應(yīng)的cDNA序列（300 bp）。結(jié)果表明擴(kuò)增片段大小與預(yù)期值相符（圖1）。選用Nde I、 Xho I酶切位點(diǎn), 將PCR產(chǎn)物克隆入pET21c質(zhì)粒,

11、 并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行了雙酶切鑒定（圖1）和序列測(cè)定。圖1  Autotaxin(58157)His6原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建（略）1: DNA marker （DL 5 000）;  2: PCR產(chǎn)物; 3: pET21cAutotaxin(58157)質(zhì)粒酶切鑒定. 2.2  Autotaxin(58157)His6融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化  與未誘導(dǎo)的菌株相比, 轉(zhuǎn)化了pET21cAutotaxin(58157)重組質(zhì)粒的E.coli BL21菌株, 經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)在相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）11 000和17 000之間出現(xiàn)了1條明顯的條帶, 大小與

12、Autotaxin(58157)His6的理論值13 000相符（圖2）, 表明重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。超聲破碎后, SDSPAGE分析表明目的蛋白存在于上清中, 即目的蛋白可溶。經(jīng)過親和純化, 將獲得的目的蛋白進(jìn)行SDSPAGE分析, 可見單一的條帶, 證明蛋白純化成功, 純度達(dá)到90以上（圖2）。經(jīng)過PBS透析后, 用BCA法測(cè)定蛋白濃度, 純化蛋白濃度為2.7 g/L。圖2  Autotaxin(58157)His6蛋白的表達(dá)與純化（略）M: 蛋白marker; 1: 未誘導(dǎo)的菌體蛋白; 2: 誘導(dǎo)后的菌體蛋白; 3: 超聲破碎后的上清蛋白; 4: 雜蛋白洗脫液中的蛋白; 5:

13、空白洗脫緩沖液; 6: 親和純化的蛋白.2.3  多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定  將透析定量后的Autotaxin(58157)His6融合蛋白與弗氏完全佐劑等量乳化后, 對(duì)家兔進(jìn)行免疫, 免疫6次后采集抗血清。將免疫6次后采集的抗血清作為陽性血清（P）, 以家兔免疫前血清作為陰性對(duì)照（N）, 用純化的Autotaxin(58157)His6蛋白為抗原, 間接ELISA法測(cè)定多克隆抗體效價(jià)。以不加抗原的空白孔的吸光度校零后, 2倍于陰性對(duì)照吸光度值的抗體最高稀釋倍數(shù)作為抗體的效價(jià)。如表1所示, 抗血清的效價(jià)達(dá)到125 000, 說明經(jīng)過6次免疫, 家兔體內(nèi)產(chǎn)生了高效價(jià)的抗體。2.4

14、  多克隆抗體特異性的測(cè)定  為了檢測(cè)多克隆抗體是否可以特異性地檢測(cè)到ATX蛋白, 用pcDNA4Autotaxin瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞, 分泌表達(dá)全長Autotaxin, 并以轉(zhuǎn)染空載pcDNA4的HeLa細(xì)胞為陰性對(duì)照。制備的抗Autotaxin多克隆抗體在pcDNA4Autotaxin轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清中可檢測(cè)到大小為125 000的單一條帶（圖3）, 與Autotaxin的大小相符, 轉(zhuǎn)染空載pcDNA4的陰性對(duì)照中則沒用信號(hào), 表明制備的多克隆抗體可以靈敏、 特異地檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的Autotaxin。表1  抗Autotaxin多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)（略）2.5  多克隆抗體在免疫組化中的應(yīng)用  選取結(jié)直腸癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。與免疫前的陰性血清相比, 制備的抗Autotaxin多克隆抗體在結(jié)直