EGCG對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞增殖及炎癥因子調(diào)控的影響

1、EGCG對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞增殖及炎癥因子調(diào)控的影響         10-02-04 14:33:00     作者：李娟，李彩蓉，程建    編輯：studa20【摘要】  目的 探討表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞增殖及炎癥因子（MCP1和ICAM1）分泌的影響。方法 通過(guò)體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞進(jìn)行研究。設(shè)立低糖對(duì)照組（NG）和高糖組（HG、E100、E200、E400，為分別含EGCG

2、0、100、200、400g·L-1），分別培養(yǎng)12、24、48h。CCK細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)不同濃度EGCG作用下大鼠系膜細(xì)胞的OD值，判斷細(xì)胞增殖情況。采用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清中MCP1和ICAM1蛋白濃度。結(jié)果 EGCG能抑制高糖時(shí)系膜細(xì)胞的增殖活性，其抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴的方式。系膜細(xì)胞處于高糖環(huán)境時(shí)，MCP1和ICAM1蛋白表達(dá)上調(diào)，低濃度的EGCG對(duì)MCP1和ICAM1蛋白的抑制效果不明顯，高濃度的EGCG能明顯抑制MCP1和ICAM1的分泌。結(jié)論 在體外高糖條件下，大鼠系膜細(xì)胞在48h內(nèi)以增殖為主，一定濃度的EGCG可抑制其增殖。EGCG可在蛋白水平抑制高糖刺激

3、的大鼠系膜細(xì)胞MCP1和ICAM1的分泌。 【關(guān)鍵詞】  糖尿病腎??；系膜細(xì)胞；單核細(xì)胞趨化蛋白1；細(xì)胞間粘附分子1；表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯    ABSTRACT： Objective  To explore the effects of epigallocatechin3gallate (EGCG) on proliferation of mesangial cells and the contents of Monocyte chemoattractant protein1(MCP1) and intercellular adhesio

4、n molecule1 (ICAM1) in high glucose cultured rat mesangial cells. Methods  Rat mesangial cells were divided into control group (low glucose 5.5 mmol·L-1 without EGCG) and experiment groups (high glucose 25 mmol·L-1 with EGCG (0, 100, 200, 400g·L-1), each group was incubated for 1

5、2, 24, 48 hours. The growth inhibiting effect of EGCG on mesangial cells was measured by CCK8 methods. The levels of MCP1 and ICAM1 in supernatant were determined by enzymelinked immunosorbant assay (ELISA). Results  The results showed that hyperglycemia stimulated mesangial cell proliferation

6、and release of MCP1 and ICAM1. EGCG could inhibit cell growth in a dose and timedependent manner. In addition, high concentrations of EGCG could also decrease the levels of MCP1 and ICAM1 in supernatant. Conclusion  EGCG can significantly inhibit proliferation and secretion of MCP1 and ICAM1 in

7、 high glucose induced rat mesangial cells.    KEY WORDS: Diabetic nephropathy;Mesangial cell;Monocyte chemoattractant protein1;Intercellular adhesion molecule1;Epigallocatechin3gallate    糖尿病腎?。―N）是糖尿病特有的慢性微血管并發(fā)癥，其病變周圍常有大量單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，后者與細(xì)胞粘附分子及化學(xué)趨化因子有關(guān)。SassyPrigent等1證實(shí)在鏈脲

8、佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，腎小球表達(dá)過(guò)量的細(xì)胞間粘附分子1 ( ICAM1)、VCAM1及單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP1)等細(xì)胞因子，導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，隨后出現(xiàn)IV型膠原鏈mRNA增加，系膜細(xì)胞面積增加及腎小球肥大。說(shuō)明糖尿病狀態(tài)下腎組織中粘附分子、趨化因子導(dǎo)致早期單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)在致腎小球硬化中起著重要作用。    表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin3gallate,EGCG）為綠茶中的一種有效成分。茶多酚具有清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗突變、抗腫瘤、抗炎、抗病毒和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)肥胖、糖尿病、腫瘤

9、等多種疾病均有明顯的藥理作用。本實(shí)驗(yàn)采用高糖環(huán)境下培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞，探討EGCG干預(yù)后對(duì)系膜細(xì)胞增殖及炎癥因子ICAM1和 MCP1蛋白影響，初步探索EGCG對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)機(jī)制。    1  材料和方法    1.1  材料    大鼠腎系膜細(xì)胞株HBZY1（中國(guó)典型動(dòng)物保藏中心提供），培養(yǎng)于含10胎牛血清（FCS）的正常糖DMEM中，常規(guī)置于37、5CO2培養(yǎng)箱中孵育，用0.25胰蛋白酶消化傳代，每周傳代23次。EGCG購(gòu)自Sigma公司，純度98%；正常葡萄糖（含5.5

10、mmol·L-1 D葡萄糖）及高糖（含25mmol·L-1 D葡萄糖）DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；FCS購(gòu)自天津正江科技有限公司；CCK試劑購(gòu)自上海同仁化學(xué)研究所；大鼠MCP1和ICAM1試劑盒（ELISA）購(gòu)自美國(guó)TPI公司。酶標(biāo)儀（BIOTEK FL800）為美國(guó)產(chǎn)品；細(xì)胞分析儀/CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)儀為德國(guó)CASY公司產(chǎn)品。    1.2  方法8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期系膜細(xì)胞，以2000個(gè)/孔鋪于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，吸去原有DMEM培養(yǎng)液，換為1%FCS培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h

11、使所有細(xì)胞的生長(zhǎng)同步化。隨即分5組：NG組（對(duì)照組，葡萄糖5.5mmol·L-1），HG組（高糖組，葡萄糖25mmol·L-1），E100組，HGEGCG（100g·L-1），E200組，HGEGCG（200g·L-1），E400組，HGEGCG（400g·L-1）。空白對(duì)照組只加低糖培養(yǎng)基而不加細(xì)胞。各組分別培養(yǎng)12、24、48h，終止前2h在每個(gè)孔內(nèi)加入10l的CCK8試劑。應(yīng)用Spectrafluor Plus光度儀（TECAN公司）在450nm處測(cè)定吸光度。以空白對(duì)照組調(diào)零，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。吸光度的改變反應(yīng)細(xì)胞活力的變化。 &

12、#160;  雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)細(xì)胞上清中MCP1和ICAM1含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。每項(xiàng)指標(biāo)設(shè)6孔，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)的含量，為排除細(xì)胞數(shù)目對(duì)上清中MCP1和ICAM1含量的影響，對(duì)每孔細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行校正，按每孔細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)來(lái)校正所得數(shù)據(jù)。    1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，率的比較用2檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，進(jìn)行方差分析和Studentt檢驗(yàn)，以P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。&

13、#160;   2  結(jié)  果    2.1  CCK8法檢測(cè)的各組細(xì)胞增殖活力比較    培養(yǎng)48h以內(nèi)，高糖可促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖(與對(duì)照組相比，P<0.05 ) 。作用早期(12h)EGCG對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用不顯著；隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)(24h及48h)，各濃度組EGCG的抑制作用明顯增強(qiáng)。對(duì)于同一濃度的EGCG而言，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率升高；對(duì)于同一時(shí)間而言(24h及48h)隨EGCG濃度的升高，抑制作用加強(qiáng)。說(shuō)明EGCG對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用具有時(shí)間、劑量依賴效應(yīng)。見(jiàn)表1。表1  不同濃度、時(shí)間的EGCG作用于各組大鼠系膜細(xì)胞的OD值（CCK）比較與NG組比較，*P<0.05、*P<0.01；與HG組比較，P<0.05、P<0.01    2.2  ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液MCP1的含量比較    本研