喉鱗癌組織與相鄰正常黏膜的基因表達(dá)譜差異

1、喉鱗癌組織與相鄰正常黏膜的基因表達(dá)譜差異     【摘要】  目的：研究喉鱗癌組織與相鄰正常黏膜的基因表達(dá)譜差異。方法：對(duì)2例經(jīng)病理證實(shí)的喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本和鄰近的正常黏膜組織標(biāo)本與基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交，利用激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)掃描芯片雜交信號(hào)，獲得樣品中基因序列及表達(dá)信息。結(jié)果：對(duì)比2例喉癌和鄰近正常組織的基因表達(dá)圖譜，發(fā)現(xiàn)癌組織和正常組織存在差異表達(dá)，2例標(biāo)本重復(fù)出現(xiàn)且差異表達(dá)的基因共74個(gè)，其中喉癌組織表達(dá)上調(diào)的基因(R5)27個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因(0R0.2)47個(gè)。結(jié)論：利用基因表達(dá)譜芯片可以在喉鱗狀細(xì)胞癌組織和鄰近的正常組織之間一次

2、比較7000多個(gè)基因表達(dá)變化，并能找出病理組織中表達(dá)異常的基因。 【關(guān)鍵詞】  喉腫瘤 鱗狀細(xì)胞癌 基因表達(dá) 基因芯片      ADifferentially expressed genes in  laryngeal squamous cell    ABSTRACT  Objective: To screen for the differentially expressed genes in laryngeal squamous carcinoma cells and norma

3、l laryngeal tissues using  cDNA microarray. Methods: The samples from two laryngeal squamous carcinoma tissues were tested using DNA microarrays. The DNAs were fixed on a glass plate by a series of treatments. The mixed probes were then hybridized to DNA microarrays and scanned for fluorescent

4、signals. Differences between the two tissues were produced. Results: Ran belonging to Ras gene family increased 12.207 times, RAB32 belonging to Ras gene family increased 4.904 times and BIRC5 (Survivin) increased 15.495 times. They were significantly highly expressed in  laryngeal cancer. The

5、GFI1B gene decreased 0.0265 times. The GATA1 gene was significantly lowly expressed in one laryngeal cancer and was not expressed in carcinoma cells of another patient. Conclusion: cDNA microarray made in our Lab can recognize more than 7000 gene differences between cancer tissues and normal tissues

6、 at the same time and find  gene variation. These results accord with other studys.    KEY WORDS  Laryngeal neoplasms; Squamous cell carcinoma; Gene expression; DNA microarray    喉癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其中鱗狀細(xì)胞癌占90%以上1。我們利用基因芯片法，對(duì)來源于不同個(gè)體、不同細(xì)胞周期、不同分化程度的細(xì)胞內(nèi)的mRNA進(jìn)行檢測(cè)，分析正常組

7、織與喉癌組織基因表達(dá)譜的差異，動(dòng)態(tài)地了解細(xì)胞從正常到癌變的不同階段基因表達(dá)譜的變化，為喉癌的早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供理論基礎(chǔ)。    1  資料與方法    1.1  臨床標(biāo)本  2例經(jīng)病理證實(shí)的男性喉癌標(biāo)本，由天津市第一中心醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科提供，患者分別為58、65歲；病理類型均為鱗狀細(xì)胞癌，1例是T3N0M0，1例T4N1M0。根據(jù)臨床分期行全喉切除術(shù)，術(shù)后即刻切取癌組織及鄰近正常組織約700?mg，迅速放入液氮凍存。    1.2  表達(dá)譜芯片的制備

8、  用自動(dòng)點(diǎn)樣儀(美國PE公司,SpotArray)將大約15?000個(gè)基因點(diǎn)于芯片片基上。點(diǎn)樣區(qū)分為4個(gè)DNA矩陣,共包含7267個(gè)人類基因, 分為human cancer、 apoptosis、 signal transduction 和liver enzymes 4部分。每個(gè)人類基因有兩個(gè)復(fù)點(diǎn)。點(diǎn)樣后在雜交前于300?mJ紫外交聯(lián)。待烤箱溫度升至110? 130?后，迅速打開烤箱門，將裝有玻片的提籃放入烤箱中干烤5?s后立即取出。0.2SDS的3×SSC溶液搖動(dòng)（60YPM）洗滌2次，每次1?min。高純水搖動(dòng)（60YPM）洗2次，每次1?min。0.256NaBH4

9、搖動(dòng)（60YPM）1?min封閉。高純水搖動(dòng)（60YPM）洗滌1次1?min。0.2SDS的3×SSC溶液搖動(dòng)（60YPM）洗滌1次1?min。高純水搖動(dòng)（60YPM）洗滌2次，每次1?min。將玻片放入離心管中，2?000?r/min離心5min（平角離心機(jī)）。取出，置于-20?備用。    1.3  差異基因檢測(cè)  計(jì)算基因在標(biāo)本中信號(hào)值的比值(Radio)，用以表示表達(dá)基因的差異性。    Radio(CH2 MedianCH2 B Median)/    (CH1 M

10、edianCH1 B Median)    基因表達(dá)差異有顯著性意義的判定標(biāo)準(zhǔn)為：(1)Radio5; (2)0Ratio0.2;(3)Ratio0且CH2 MedianCH2 B Median1000, Ratio0且CH1 MedianCH1 B Median1000。再進(jìn)行一致性點(diǎn)的篩選，即選出同一基因的兩個(gè)點(diǎn)的Radio都符合標(biāo)準(zhǔn)。最后將2例標(biāo)本符合標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)對(duì)比，篩選出共同的基因。對(duì)篩選出的點(diǎn)作進(jìn)下一步分析。    2  結(jié)  果    2.1  總RNA提取的定性定量分析及cDNA分析結(jié)果  將提取的喉癌組織和鄰近正常組織的總RNA進(jìn)行1瓊脂糖凝膠電泳,其對(duì)應(yīng)于28?s和18?s的兩條帶的亮度之比約為21，見圖1。應(yīng)用紫外分光光度法測(cè)得RNA在260nm和280nm的OD值比值,均在1.8 2.0之間，符合基因芯片實(shí)驗(yàn)要求。cDNA分析顯色好，復(fù)點(diǎn)顯色一致。    圖1  RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳掃描圖像    N：正常