當(dāng)歸注射液對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后PTEN的表達(dá)及統(tǒng)計(jì)分析

1、         11-06-01 09:41:00     作者：葉皓    編輯：studa20【摘要】  目的：探討當(dāng)歸注射液對(duì)缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞PTEN的表達(dá)及統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方法:將35只SD大鼠隨機(jī)分成4組(n=10):正常對(duì)照組(n=5);假手術(shù)組(n=10);缺血再灌注組(n=10);當(dāng)歸治療組(n=10) ,建立在體心肌缺血再灌注動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)完畢后，將各組動(dòng)物心肌組織做免疫組織化學(xué)染色;觀察各組動(dòng)物心肌細(xì)胞

2、內(nèi)PTEN表達(dá)的變化。利用HPIAS2000圖像分析系統(tǒng)測定PTEN在以上各組中表達(dá)的平均光密度和平均陽性面積率。結(jié)果：正常對(duì)照組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達(dá)呈陰性;假手術(shù)組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達(dá)呈陰性;缺血再灌注損傷組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見大量的棕黃色顆粒沉積，PTEN表達(dá)呈陽性;當(dāng)歸治療組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達(dá)呈陰性。圖像分析結(jié)果顯示：正常對(duì)照組、當(dāng)歸治療組、 假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間PTEN表達(dá)的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01);正常對(duì)照組與假手術(shù)組之間、當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組之間P

3、TEN表達(dá)的平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0.05)。結(jié)論：當(dāng)歸注射液對(duì)大鼠缺血再灌注損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡有重要的保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】  當(dāng)歸注射液; 缺血再灌注; 心肌; 細(xì)胞凋亡; PTEN心肌缺血再灌注損傷( ischemia / reperfusion, I/R), 是指在短時(shí)間心肌血供中斷, 一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血供, 原缺血心肌發(fā)生較血供恢復(fù)前更嚴(yán)重的損傷。隨著心臟外科體外循環(huán)、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、復(fù)雜先天性心臟病糾治術(shù)、及溶栓等治療的推廣應(yīng)用, 已成為阻礙心血管治療療效的主要難題1。近年,中草藥在心肌缺血再灌注損傷中的作用受到越來越多的關(guān)注, 中草藥舒張

4、冠狀血管、改善冠脈循環(huán), 減輕氧化損傷等均是其發(fā)揮心臟保護(hù)作用的重要機(jī)制2。當(dāng)歸為傘形科(Umbrelliferae)植物的干燥塊根,藥性甘、辛、溫,入肝、心、脾經(jīng), 具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤燥滑腸等功效3，4。當(dāng)歸屬于和血類藥物(指有養(yǎng)血、調(diào)和血脈作用的藥物) 。近年來，有不少學(xué)者對(duì)中藥預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用進(jìn)行了研究與探索。PTEN 基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙特異性磷酸酶(DPS) 活性的抑癌基因,該基因在細(xì)胞的生長、增殖、遷移和細(xì)胞凋亡中具有重要的生物學(xué)功能5。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法觀察當(dāng)歸注射液對(duì)缺血/再灌注過程心肌細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá),探討當(dāng)歸注射液對(duì)心肌缺

5、血/再灌注損傷的作用機(jī)理。1 材料與方法1.1 材料1.2 主要試劑25%當(dāng)歸注射液(武漢大學(xué)中南醫(yī)院制藥廠);即用型兔抗鼠Bim多克隆抗體，即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒，DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸。以上試劑均購于北京中山生物技術(shù)有限公司。1.3 方法P法檢測PTEN相關(guān)抗原 主要步驟：5m組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫處理10 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，Ki67均采用高壓抗原修復(fù)，正常羊血清處理10 min以減少非特異性背景，一抗4孵育過夜，生物素標(biāo)記的二抗處理10 min，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物處理10min，DAB顯色液顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)

6、染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組。1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷PTEN以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對(duì)照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)對(duì)PTEN抗原的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和q 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。2 結(jié)果PTEN的表達(dá)

7、 正常對(duì)照組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達(dá)呈陰性;假手術(shù)組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量棕黃色顆粒，PTEN表達(dá)呈陰性;缺血再灌注損傷組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見大量的棕黃色顆粒沉積，PTEN表達(dá)呈陽性;當(dāng)歸治療組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達(dá)呈陰性。圖像分析結(jié)果顯示：正常對(duì)照組：PTEN表達(dá)的平均光密度為0.1925±0.0011，假手術(shù)組：PTEN表達(dá)的平均光密度為0.2013±0.0024，缺血再灌注損傷組：PTEN表達(dá)的平均光密度為0.8974±0.0086;當(dāng)歸治療組：PTEN表達(dá)的表達(dá)的平均光密度為0.2183±0.003

8、8;正常對(duì)照組：PTEN表達(dá)的陽性面積率為0.2038±0.0023，假手術(shù)組：PTEN表達(dá)的陽性面積率為0.2159±0.0026，缺血再灌注損傷組：PTEN表達(dá)的陽性面積率為0.9631±0.0077;當(dāng)歸治療組：PTEN表達(dá)的表達(dá)的陽性面積率為0.2485±0.0048。經(jīng)單因素方差分析，各組間的差異有顯著性意義(P<0.05)。經(jīng)q 檢驗(yàn)，正常對(duì)照組、當(dāng)歸治療組、 假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間PTEN的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01);正常對(duì)照組與假手術(shù)組之間、當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組之間PTEN平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P&