土壤微生物多樣性研究方法

1、應(yīng)用生態(tài)學(xué)報 2004 年 5 月第 15 卷第 5 期 CHIN ESE J OU RNAL O F A PPL IED ECOL O GY ,May 2004 ,15 (5) 899904土壤微生物多樣性研究方法31 ,2 3 31鐘文輝 蔡祖聰(1 中國科學(xué)院南京土壤研究所 ,南京 210008 ;2 南京師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 ,南京 210097)【摘要】概述了研究土壤微生物多樣性的主要方法. 傳統(tǒng)上 ,土壤微生物群落的分析依賴于培養(yǎng)技術(shù) ,使用各種培養(yǎng)基最大限度地培養(yǎng)各種微生物群體 ,但仍只能培養(yǎng)和分離出一小部分土壤微生物群落. 使用Biolog 分析、磷脂脂肪酸分析和核酸分析

2、等方法 ,可研究和表征那些現(xiàn)在還不能夠被培養(yǎng)的土壤微生物 ,從而獲取關(guān)于土壤微生物群落多樣性的更多和更完整的信息.關(guān)鍵詞 土壤 微生物多樣性 Biolog 磷脂脂肪酸核酸分析文章編號 1001 - 9332 (2004) 05 - 0899 - 06 中圖分類號 S15413 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 AMethods f or studying soil microbial diversity. ZHON G Wenhui1 ,2 ,CA I Zucong1 (1 I nstit ute of S oil S cience , Chi2nese A cadem y of S cience , N anji

3、 ng 210008 , Chi na ;2 College of Chem ist ry an d En v i ron ment al S cience , N anji ng N or m al U ni versity , N anji ng 210097 , Chi na) . 2Chi n . J . A ppl . Ecol . ,2004 ,15 (5) :899904 .This paper gave a review on t he main met hods for st udying soil microbial diversity. Traditionally ,t

4、he analysis of soil microbial communities relied on cult uring techniques ,using a variety of cult ure media. However ,only a small f raction of t he soil microbial community has been cult ured and isolated wit h t his app roach. Ot her met hods such as Biolog GN analysis ,p hosp holipids fat ty aci

5、ds analysis and nucleic acid2based analysis can be used to st udy and characterize soil microbes which currently cannot be cult ured ,and to get more and complete information about soil microbial community.Key words Soil , Microbial diversity , Biolog , FL FA , Nucleic acid2based analysis.平板上的微生物群落的

6、組成. 在后一種情況下 ,需從瓊脂平1 引 言生物多樣性包括物種多樣性、遺傳(基因) 多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性. 土壤微生物多樣性包括在棲息地中微生物分類群的多樣性和在微生物分類群內(nèi)的遺傳多樣性 ,以及包括群落結(jié)構(gòu)的變異性、相互作用的復(fù)雜性、營養(yǎng)水平( t ropic level)和共位群(guild) 數(shù)量(功能多樣性) 在內(nèi)的生態(tài)多樣性. 其中遺傳多樣性可認(rèn)為是遺傳信息在微生物聚集地或群落中的量和分布 ,反映微生物群落中總的遺傳潛力. 功能多樣性則是指發(fā)生在一個群落中的碳源利用模式或作用過程數(shù) 33 .土壤微生物多樣性的研究方法大體上可分為兩類 :一類是用于分析土壤中可培養(yǎng)的微生物群落 ;另

7、一類是用于分析土壤的整個微生物群落. 第一類分析方法基于微生物分離菌(isolates) 的形態(tài)判別、微生物分離菌在 Biolog GN 微滴定板中的反應(yīng)和微生物分離菌的脂肪酸甲酯譜( FAM E p rofiles)等. 后一類分析方法不需要培養(yǎng)微生物 ,包括群落水平的生理特性(CL PP) 分析 (如在 Biolog GN 微滴定板中的反應(yīng)分析) 、磷脂脂肪酸(p hosp holipid fat ty acids , PL FA) 方法和核酸 分析( nucleic acid2based analysis) 方法等.2 瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)方法板上將菌落分離出來 ,并對分離菌進(jìn)行鑒定. 由所得

8、到的分類組或分類群的分布情況可了解群落的結(jié)構(gòu).培養(yǎng)基的成份影響微生物的生長狀況 ,故培養(yǎng)基的選擇可強烈影響所得菌落的多樣性 34 ,64 . 菌落形成單位 ( CFU)的數(shù)量通常隨培養(yǎng)基營養(yǎng)濃度的降低而增加 40 ,49 . 然而 ,只有一小部分土壤微生物群落可用這種方法得到. F · gri 等 16 用熒光顯微鏡檢術(shù)檢出的細(xì)菌數(shù)比用培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的細(xì)菌數(shù)提高 1001000 倍. 根據(jù) Amann 等 3 的評估 ,大約 80 %99 %的微生物種不可培養(yǎng)或未能得到培養(yǎng) ,說明大部分微生物的特征不能用傳統(tǒng)的瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)技術(shù)來描述.此外 ,瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)方法需要使用包括分子生

9、物學(xué)手段在內(nèi)的分析技術(shù) ,才能完成對微生物種的鑒定 ,分析工作煩瑣 ,工作量大. 由于以上局限性 ,在出現(xiàn)新的評價微生物多樣性的方法 ,特別是分子方法以后 ,該傳統(tǒng)方法已逐漸失寵.3 Biolog GN 方法Biolog GN 分析方法是一種群落水平的生理特性分析方法. 它是基于微生物利用碳源能力的不同 , 利用 Biolog GN系統(tǒng)來研究微生物的碳源利用模式的方法. Biolog GN 微滴定板的每一個孔中含有一種不同的碳源(共 95 種) 、其它營這是用于估計微生物多樣性的傳統(tǒng)方法. 瓊脂培養(yǎng)基培國家杰出青年基金資助項目(40125004) .養(yǎng)方法是在瓊脂培養(yǎng)基平板上接種培養(yǎng) ,可作以

10、下用途 : 跟33通訊聯(lián)系人.蹤特定分類組( group) 或功能組的微生物數(shù)量 ,并評價在該2002 -02 -20收稿,2003 - 07 - 15接受.3900應(yīng)用生態(tài)學(xué)報 15 卷養(yǎng)物和四氮唑染料. 接種微生物懸浮物于微滴定板孔中后 ,將滴定板保溫一段合適的時間 ,通過測定伴隨的四氮唑染料的還原 ,而定期監(jiān)測底物的氧化. Biolog GN 微滴定板原來用作對細(xì)菌分離菌進(jìn)行分類 6 . 然而 ,這種方法現(xiàn)已被改進(jìn) ,用于表征土壤微生物群落的功能潛力 ,即被用于估計諸如碳源利用模式等功能多樣性 21 . Biolog GN 分析方法當(dāng)作此用途時 ,接種物是來自土壤微生物群落的混合物 (

11、而不是純培養(yǎng)) ,所得結(jié)果采用一定的統(tǒng)計方法進(jìn)行分析.采用該方法時接種量和培養(yǎng)時間很重要. 研究表明 ,底物的氧化取決于所用接種物的組成和密度 20 ,23 ,77 . 另外 ,被接種的微生物的生理狀態(tài)可能影響底物利用的動力學(xué)和模式 35 . 在測定過程中 ,微生物只在含有適合其利用碳源的孔中生長 21 ,23 ,77 . 因此 ,所觀察到的底物利用模式可能只反映了那些在 Biolog GN 微滴定板孔中能夠生長的微生物的功能特性 ,且很可能不是所有的微生物都對 Biolog 反應(yīng)特征有貢獻(xiàn) 23 ,28 . 所得到的碳源利用模式也不一定反映接種的微生物群落中數(shù)量上占優(yōu)勢的成員的功能潛力 62

12、 .該方法已用于了解土壤 23 ,41 ,77 和根際 20 中微生物群落間的差異 ,也有的研究者用它確定非土著微生物或轉(zhuǎn)基因植物對土壤 13 ,75 、植物凋落物 32 ,52 、根際 28 和葉際 28 微生物群落的影響.Biolog GN 方法具有快速而可再現(xiàn)的特點. 然而 ,該方法對快速生長和適合在實驗條件下生長的小部分群落成員有強烈的選擇性 62 ,故與從瓊脂平板分離微生物的傳統(tǒng)方法有同樣的局限性 ;另一缺點是被測試的底物不能準(zhǔn)確地代表出現(xiàn)于生態(tài)系統(tǒng)中的底物類型. 因此 ,Biolog 反應(yīng)特征只能粗略地代表實際土壤微生物群體底物利用的動力學(xué)特征.4 磷脂脂肪酸方法411 PL FA

13、 在微生物中的分布磷脂脂肪酸譜( PL FA p rofile) 常被用于研究復(fù)雜群落中微生物的多樣性 54 ,79 . 磷脂是所有生活細(xì)胞的細(xì)胞膜的基本組分. PL FA 是磷脂的組分 ,具有結(jié)構(gòu)多樣性和高的生物學(xué)特異性 ,是特別有效的生物標(biāo)記物 ,可用于了解微生物群落結(jié)構(gòu). 總 PL FA 譜中某些特征脂肪酸分別對細(xì)菌、真菌和放線菌是特異的 74 ,且在大多數(shù)情況下 PL FA 的某專一類型在某一土壤微生物分類群中占優(yōu)勢. 至今 ,已經(jīng)積累了大量關(guān)于微生物脂類的脂肪酸組成的數(shù)據(jù). PL FA 或酯鏈PL FA ( EL2PL FA) 的總量已被用作土壤樣品中微生物生物量的指示物(indic

14、ator) 80 . 細(xì)菌含有在其它生物中常見的直鏈 脂肪酸 ,如油酸或順型異油酸 十八碳2112稀酸(順) ,簡寫為1817 或 1817c 等單不飽和脂肪酸( MU FA) . 然而 ,細(xì)菌 獨特的脂肪酸是具分枝鏈、環(huán)丙基和2羥基脂肪酸. 這些脂肪酸在其它生物體中不普遍存在 38 . 支鏈脂肪酸主要發(fā)現(xiàn)于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性的硫酸鹽還原菌、Cytop haga和黃桿菌屬 24 ,而環(huán)丙基脂肪酸常見于革蘭氏陰性菌株以及革蘭氏陽性厭氧菌株 57 . MU FA 特別是 1817 具有厭氧2去飽和酶途徑的真細(xì)菌特征 ,很多這種細(xì)菌是革蘭氏陰性菌 79 . 雖然 MU FA 可出現(xiàn)在革蘭氏陽性

15、和陰性細(xì)菌中 ,但在革蘭氏陽性細(xì)菌中它們對總 PL FA 的相對貢獻(xiàn)很少 ( <20 %) ,故 MU FA 可用作革蘭氏陰性細(xì)菌的通用生物標(biāo)記 57 . 多不飽和脂肪酸( PU FA) 被認(rèn)為是真核生物的特征性 脂肪酸. 亞油酸 (十八碳29 , 122二稀酸 (順 , 順) , 簡寫為 18 26) 可作為真菌的一個通用生物標(biāo)記. 但 Sundh 等 66 推斷 ,這種脂肪酸可能不是對每一生態(tài)系統(tǒng)都合適的生物標(biāo)記 ,可能只在植物細(xì)胞不存在的生態(tài)系統(tǒng)中是真菌的較好標(biāo)記.非酯鏈未取代脂肪酸 ( non2ester2linked unsubstantiated FA ,N EL2U N S

16、FA) 是鞘脂和縮醛磷脂的組分. 鞘脂已發(fā)現(xiàn)存在于擬桿菌屬/ 黃桿菌屬 60 . 近來也發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性多聚氯酚降解細(xì)菌(被鑒定為 Sp hingomonas 屬) 含有鞘脂 46 . 縮醛磷脂主要存在于梭狀芽孢桿菌屬等厭氧細(xì)菌中 74 ,只有很少數(shù)的好氧和兼性厭氧細(xì)菌含有縮醛磷脂 79 . 真菌菌絲中 已被檢測出存在長鏈非酯鏈羥基取代脂肪酸 ( non2ester2 linked hydroxyl substit uted FA , N EL2H YFA) 75 . 在脂肪酸第10 位碳原子處甲基分枝是放線菌所特有的 37 . 表征幾大類微生物的重要脂肪酸見表 1 .表 1 表征微生物的 PL

17、 FA 29 , 32Table 1 PL FA signatures of microbes微生物類型 Microbial group磷脂脂肪酸標(biāo)記 Phosp holipids fatty acid signat ures細(xì)菌Bacteria in general含有以酯鏈與甘油相連的飽和或單不飽和脂肪酸( 如 15 0 、i150 、a150 、16 0 、i16 0 、16 15 、1619 、1617t 、170 、i170 、a170 、cy170 、1815 、1817 、1817t 、i190 ,a190 和2cy190 等) Contain sat urated or mon

18、ounsat urated fatty acids ester linked to glycerol含有多種分枝脂肪酸 Contain more branched fatty acids革蘭氏陽性細(xì)菌 Gram positive bacteria22含有多種羥基脂肪酸 Contain more hydroxylated fatty acids ; MU FA革蘭氏陰性細(xì)菌 Gram negative bacteria厭氧細(xì)菌 Anaerobescy170 ,cy190好氧細(xì)菌 Aerobes1617 、1617t 、1817t硫酸鹽還原細(xì)菌 Sulfate reducing bacteria1

19、0Me160 、i1717 、171622甲烷氧化細(xì)菌 Met hane oxidizing bacteria1618c ,1618t ,1615c ,1818c ,1818t ,1816c嗜壓/ 嗜冷細(xì)菌Barop hilic/ p sychrop hilic bacteria205 ,226黃桿菌 Fl av bacteri u m bal ust i n u mi1717 ,Br 2O H 150芽孢桿菌 B aci l l us spp1各種枝鏈脂肪酸 Various branched chain fatty acids放線菌 A ct i nobacteri a10Me160 、10

20、Me170 、10Me180 等真菌 Fungi含有特有的磷脂脂肪酸如 1819 、1826 、1836 、1833 Contain a specific PL FA such as1819 、1826 、1836 、1833藍(lán)細(xì)菌 Cyanobacteria含有多不飽和脂肪酸如 1826 Lipids containing polyunsat urated fatty acids such as 1826微藻類 Microalgae1633原生動物 Protozoa2036 、2046i 、a 、cy 和 Me 分別表示反異(anteiso) 、異(iso) 、環(huán)丙基(cyclop ropy

21、l) 和甲基( met hyl) 分枝脂肪酸25 期 鐘文輝等:土壤微生物多樣性研究方法 901412 PL FA 的分離和分析PL FA 的提取和分析是 PL FA 方法的關(guān)鍵步驟. PL FA的提取主要采用簡單提取、擴(kuò)展提取和商用微生物鑒定系統(tǒng)( M ID I) 提取等方法 79 .簡單提取用于提取 EL2PL FA. 先用有機溶劑提取土壤 中的細(xì)胞脂類 ,將提取液上樣于硅酸鍵合固相抽提柱( solid2 p hase2ext raction silicic acid bonded p hase column , SP E2SI) ,分別用氯仿、丙酮和甲醇洗脫 ,可將脂類裂解 ,并分離出中

22、性脂、糖脂和磷脂. 用溫和堿性甲醇將磷脂水解和皂化 ,得到酯 鏈脂肪酸甲酯( EL2FAM E) ,進(jìn)一步用 GC 或 GC2MS 進(jìn)行定 性和定量測定. 這種提取方法不能將非酯鏈 PL FA ( N EL2PL FA) 從脂類中解離和提取出來.擴(kuò)展提取方法是在簡單提取方法的基礎(chǔ)上延伸的 ,可用 于提取包括 EL2PL FA 和 N EL2PL FA 在內(nèi)的全 PL FA. 用與 簡單提取方法相同的操作方法從土壤樣品中抽提脂類 ,將磷脂從脂類中解離出來 ,用堿性甲醇水解和皂化 ,接著用氨丙 基鍵合 , SP E 柱 (aminop ropyl2bonded SP E2column , SP E

23、2N H2 )分離皂化產(chǎn)物 ,得到未取代脂肪酸甲酯. 酯鏈羥基取代脂肪 酸( EL2H YFA) 甲酯和不皂化脂. 未取代脂肪酸甲酯用苯磺 酸鍵合. SP E 柱 ( benzenesulp honic2acid2bonded SP E column , SP E2SCX) 分離 ,得到酯鏈飽和脂肪酸 ( EL2SA TFA) 、酯鏈單 不飽和脂肪酸( EL2MU FA) 和酯鏈多不飽和脂肪酸( EL2PU2FA) 組分. 不皂化脂經(jīng)酸水解后 ,用 SP E2N H2 柱分離 ,可得到 非脂鏈脂肪酸 (包括 N EL2U N SFA 和 N EL2H YFA) . 得到的EL2PL FA 和

24、N EL2PL FA 進(jìn)一步用 GC 或 GC2MS 進(jìn)行定性和定量分析. 采用這種方法可使多數(shù)類型的脂肪酸根據(jù)它們結(jié)合成脂類的本來狀況(酯鏈 ,非酯鏈) 而得到分離. 檢測結(jié)果用多變量統(tǒng)計方法加以分析.除上述方法外 ,有些研究者還用 M ID I 來提取和分析脂肪酸 9 ,24 ,30 . 其操作方法包括用皂化/ 裂解液將脂肪酸從脂類中裂解出來 ,在 80 下加入甲醇鹽酸溶液 ,使脂肪酸甲基化形成 FAM E ,提取 FAM E ,進(jìn)行 GC 分析等幾個步驟 24 . 最后 ,用 M ID I 開發(fā)商提供的自動程序軟件對 FAM E 進(jìn)行分 析. 該方法的主要問題是提取的脂肪酸包括來自有生活

25、力的 細(xì)胞脂類和可能部分來自于細(xì)胞外的脂類 79 .用簡單提取方法和 M ID I 方法提取土壤 PL FA 得到的脂肪酸譜相似 9 ,19 ,一般有 20 至 48 種脂肪酸(最多 72 種) ,其中直鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸分別占 15 %25 %和 30 %50 % ;甲基分枝脂肪酸占 25 %40 %. 采用擴(kuò)展提取方法檢測到的 PL FA 的數(shù)量介于 190 至 360 種之間 ,且顯示出不同地點、不同耕種方式的土壤中脂肪酸的總量和種類數(shù)以及 百分比分布有顯著差異 65 ,81 . N EL2PL FA 占總 PL FA 量的21 %25 % , EL2SA TFA 和羥基取代脂肪酸(

26、包括 EL2H YFA和 N EL2H YFA) 也大量存在.413 PL FA 方法的特點和局限性PL FA 方法是一種快速、可靠而可重現(xiàn)的分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的方法 ,可用于表征在數(shù)量上占優(yōu)勢的土壤微生物群落 ,包括不可培養(yǎng)微生物. 該方法最適合用作總微生物群落分析 ,而不是專一的微生物種類的研究 15 . PL FA 的組成和濃度受土壤微生物生長條件和生理狀態(tài)的影響 31 ,74 .另外 ,包括 PL FA 在內(nèi)的所有的土壤生物標(biāo)記都存在可萃取性(ext ractability) 和未知的穩(wěn)定性問題. 土壤的生物標(biāo)記穩(wěn)定性主要取決于與降解過程有直接關(guān)系的溫度、濕度和其他條件 31 .5

27、 核酸分析方法511 總 DNA 分析研究表明 ,土壤微生物大體的群落組成和總的遺傳多樣性可通過測定群落 DNA 的解鏈行為和復(fù)性率來確定 70 ,73 .在溶液中變性單鏈 DNA 的復(fù)性率隨著 DNA 復(fù)雜性的增加或在溶液中不同 DNA 分子數(shù)量的增加而下降;DNA 濃度越大 ,復(fù)性越快. Cot1/ 2 表示復(fù)性一半的 Cot (DNA 濃度和復(fù)性時間的乘積) 值 ,與 DNA 的復(fù)雜程度成正比 ,被用作多樣性指數(shù) 71 或用于估計基因組的大小. 用該方法分析表明 ,在未擾動的有機土壤中微生物群落基因組大小相當(dāng)于 6 00010000 大腸桿菌基因組的大小 ,而在耕作土壤或受重金屬污染土壤

28、中相當(dāng)于 3501 500 大腸桿菌基因組的大小 ,且這些估計值可能是保守的 50 ,72 . 但該方法的分辨率低 ,只能確定土壤微生物群落的大體差異. 另外 , 通過測定堿基在群落DNA 中的分布 , 即鳥嘌呤和胞嘧啶的摩爾百分率 ( % G +C) ,也可得到有關(guān)總的群落組成的信息 12 .512 基于 PCR 的核糖體 DNA 分析51211 概述 大多數(shù) DNA 多樣性研究以核糖體 RNA(r RNA) 或其編碼基因 rDNA 為對象. 在微生物多樣性研究中 ,人們最感興趣的是小亞基 RNA ( SSU r RNA) 或其編碼基因 SSU rDNA. SSU rDNA 包括保守區(qū)和變異

29、區(qū). 保守區(qū)內(nèi)核苷酸序列恒定 ,在分類上相距遠(yuǎn)的微生物分類群之間才有差異;變異區(qū)能夠顯示微生物分類種的差異. SSU rDNA 的這種獨特的特性可被用來對微生物進(jìn)行系譜分類. 目前人們已經(jīng)對很多種已知微生物的 SSU rDNA/ r RNA 序列進(jìn)行了測序(大多數(shù)工作是對原核生物 16S rDNA/ r RNA 進(jìn)行的) ,建立了 SSU rDNA/ r RNA 序列數(shù)據(jù)庫. 該數(shù)據(jù)庫正在不斷擴(kuò) 大 ,目前已有足夠大的數(shù)據(jù)庫來對微生物進(jìn)行系譜分類.rDNA 分析中 ,通常用 PCR 擴(kuò)增 SSU rDNA ,擴(kuò)增產(chǎn)物 用凝膠電泳分離并進(jìn)行分析. 目前最常用的分析方法的基本步驟如下 7 ,14

30、,43 ,45 ,55 ,56 : 抽提土壤 DNA PCR 擴(kuò)增 SSUrDNA (16s rDNA 或 18s rDNA) PCR 產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(D GGE) 或溫度梯度凝膠電泳( T GGE) 分離及帶譜分析回收 D GGE 電泳片段 DNA 序列測定 將測得的 SSUrDNA 序列與 rDNA 序列數(shù)據(jù)庫中已知微生物的 rDNA 序列相比較 獲得土壤中可能含有的微生物(包括不可培養(yǎng)微生物) 的信息.與 rDNA 分析有關(guān)的問題包括 rDNA 序列的異質(zhì)性( heterogeneity) 47 和 SSU rDNA 的數(shù)量變化較大 18 等.51212 DNA 的抽提和純化 抽

31、提的 DNA 的質(zhì)量影響后續(xù)PCR 擴(kuò)增的效率和準(zhǔn)確性. 抽提中應(yīng)盡可能避免 DNA 斷902應(yīng)用生態(tài)學(xué)報 15 卷裂. 模板的濃度對 PCR 擴(kuò)增有影響. 過低的模板濃度可能會導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或不正確的擴(kuò)增 10 ,故抽提效率應(yīng)該高 ,以保證有足夠的模板濃度 26 . 此外 ,被抽提的 DNA 必須純化 ,因為土壤中可能含有抑制 PCR 反應(yīng)的腐殖酸 68 .不同的土壤類型要用不同的 DNA 抽提方法 4 ,45 . 抽提方法可分為兩種:一是先抽提土壤中的微生物細(xì)胞 ,再將細(xì)胞裂解和回收 DNA ;二是直接抽提土壤中的 DNA. 第一種方法得到的是在數(shù)量上占優(yōu)勢的微生物的 DNA ,DNA 純度

32、較高 ;第二種方法較方便、抽提較完全 ,得到的 DNA 更能代表總?cè)郝?71 . 目前大多數(shù)研究者采用第二種方法 ,該方法經(jīng)過改進(jìn)后 ,已經(jīng)能夠做到避免腐殖酸對 PCR 的抑制 31 . 對于很多土壤 ,用商用抽提試劑盒能夠快速而有效地直接抽提和純化 DNA 5 ,對另一些土壤需要用煩瑣的其它抽提方法. 從不同土壤類型抽提 DNA 的得率不同 ,變化范圍在 235g·g - 1 之間 4 .51213 rDNA 的 PCR 擴(kuò)增 首先慎重選擇待擴(kuò)增的 rDNA區(qū)域. rDNA 的 PCR 擴(kuò)增常采用不同的引物和擴(kuò)增條件分別擴(kuò)增原核微生物 16S rDNA 或真核微生物 18S rDN

33、A 的全序列或部分序列 14 ,17 ,27 ,36 ,63 . PCR 擴(kuò)增中存在著一些問題 ,如PCR 產(chǎn)物的組成不一定反映原始 DNA 模板的組成 25 ,53 ,67 ;PCR 產(chǎn)物也不一定能反映原始 DNA 模板的相對數(shù)量. 定量PCR 方法操作煩瑣 ,需要進(jìn)一步改進(jìn)和完善 ,才能在實際中應(yīng)用 48 .51214 PCR 產(chǎn)物的凝膠電泳分離 分離效果比較好的凝膠電泳方法有 D GGE 或 T GGE. D GGE 或 T GGE 均可對具有同等長度并具有不同的核苷酸序列的 DNA 片段進(jìn)行快速、可再現(xiàn)分離 27 ,44 . D GGE 分離是基于 DNA 片段在具線性變性梯度的聚丙稀

34、酰胺凝膠中遷移率的不同 ,常用的變性劑有脲和甲酰胺 44 . T GGE 可區(qū)分單個堿基水平發(fā)生取代的 DNA分子 61 . 兩種方法電泳效果基本相同 27 . 不同微生物群落的 rDNA 電泳后帶型不同 22 . 凝膠電泳的低分辯率仍然是該方法存在的一個問題 69 .51215 rDNA 的 PCR 產(chǎn)物的分析 用 PCR 方法從土壤和微生物分離菌中擴(kuò)增的 rDNA 可利用擴(kuò)增的核糖體 DNA 限制 性分析 ( t he amplified ribosomal DNA rest riction analysis , ARDRA) 技術(shù)進(jìn)行分析. 在該方法中 DNA 被用一種或幾種 限制性酶消

35、化 ,所得片段用凝膠電泳分離. 該方法的不足之 處是一組(分類群) 微生物在分析中可得到幾個片段 ,故分辨 率較低. 這個問題已在末端限制性片段長度多態(tài)性( terminal rest riction f ragment lengt h polymorp hism , T2R FL P) 分析中得 到解決. 該方法是 ARDRA 的發(fā)展 ,在 PCR 中引入了熒光標(biāo)記的引物 , PCR 產(chǎn)物也用一種或幾種限制性酶消化 ,借助熒光標(biāo)記對消化片段進(jìn)行分離和鑒定 39 ,42 .rDNA 間隔區(qū)分析 ( ribosomal internal spacer analysis , R ISA) 1 ,8

36、 則基于原核生物 16S 和 23S rDNA 基因之間的間隔區(qū)的長度多態(tài)性 ,用 PCR 方法對該間隔區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增 ,擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠電泳分離并分析帶譜 ,也可對 DNA 帶進(jìn)行測序 ,從而獲得更詳細(xì)的信息.513 雜交分析與 rDNA 的保守和變異序列同源的 DNA 片段可制成寡核苷酸探針 ,用于雜交分析. 探針可用在不同的雜交技術(shù)中 ,包括菌落和經(jīng)克隆的 PCR 擴(kuò)增子的雜交、群落 DNA 的斑點 印跡、狹線印跡雜交和完整細(xì)胞的熒光原位雜交 (fluores2cence i n sit u hybridization , F ISH) 2 ,3 ,51 ,70 .在使用印跡技術(shù)的雜交中 ,

37、從細(xì)菌菌落或經(jīng)克隆的PCR 擴(kuò)增子中來的 16S 和 23S r RNA 基因的 PCR 產(chǎn)物 ,可印跡到尼龍膜或硝酸纖維素膜中. 該印跡與經(jīng)放射性同位素、地高辛配基或其它半抗原標(biāo)記的核苷酸探針雜交. 這種方法常用于檢測和鑒定細(xì)菌 ,確定土壤中細(xì)菌群體的多樣性和結(jié)構(gòu) 51 ,59 ,比較微生物分類群變異率 59 . Ritz 等 58 應(yīng)用整個群落 DNA 雜交技術(shù) ,研究了在不同條件下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化. 在 F ISH 中 ,可用表面熒光顯微鏡術(shù) ,對具有與熒光探針雜交的核酸分子的微生物細(xì)胞進(jìn)行觀察和計數(shù) 11 . F ISH 技術(shù)使直接顯現(xiàn)( visualization) 土壤棲息

38、地的微 生物成為可能 29 ,可用于對土壤樣品中的微生物(包括不可培養(yǎng)微生物) 進(jìn)行原位檢測 3 .參考文獻(xiàn)1 Acinas S G , Anton J , Rodriguez2Valera F. 1999 . Diversity of f ree2 living and attached bacteria in off shore western Mediterranean wa2 ters as depicted by analysis of genes encoding 16s RNA. A ppl Env2 i ron M icrobiol ,65 :5145222 Amann RI

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