流動相的離子強(qiáng)度對RP.

1、流動相的離子強(qiáng)度對 RP作者：劉浩 王紅武 丁建英 仇仕林【關(guān)鍵詞】，,RP 摘要：在反相高效液相色譜（RPHPLC過程中， 流動相的離子強(qiáng)度可顯著影響可解離的化合物如抗生素的色譜峰形，原因在于 流動相的離子強(qiáng)度較低時，色譜填料的固定相易于過載，使離子化的化合物的 色譜峰形呈典型的過載特征峰形接近直角三角形。隨著進(jìn)樣量的增加，色 譜區(qū)帶中高濃度的前半部的保留時間減少，但色譜區(qū)帶均在同一時刻結(jié)束，色 譜峰的拖尾因子及峰寬均顯著增加，同時被測物與有關(guān)物質(zhì)間的分離也隨之變 差。選擇合適的緩沖鹽并適當(dāng)?shù)卦黾恿鲃酉嗟碾x子強(qiáng)度即可顯著改善抗生素的 色譜峰形，色譜峰的拖尾因子及峰寬均隨之降低，同時被測物與有

2、關(guān)物質(zhì)間也 更加易于分離。 關(guān)鍵詞： RPHPLC； 抗生素； 色譜峰形； 流動相； 離 子強(qiáng)度 Influence of the ionic strength of mobile phase on peak shape of antibiotics in RPHPLCABSTRACT The ionic strength ofmobile phase can significantly affect the peak shape of ionogenic compounds such as antibiotics in reversedphase high performance liqui

3、d chromatography （RPHPLC）. The influence may be attributed to overloading of ionogenic analytes in lower ionic strength mobile phase. In such phase, peak becomes increasingly rightangled triangle in shape with increasing sample load together with increasing peak width and tailing. The retention time

4、 of the highconcentration front decreases with increasing sample load, while the end of the peak tail has a constant retention time, equal to the symmetrical analytical peak. Due to considerably worse peak shapes, poorer resolution between the main component and its related substances might be obser

5、ved. With the optimal buffer and the increase of ionic strength, significant improvement in peak shape of antibiotics could be achieved and consequently a decrease in the tailing factor, an increase in the apparent column efficiency as well as an efficient resolution were obtained.KEY WORDS RPHPLC;

6、Antibiotics; Peakshape; Mobile phase; Ionic strength 據(jù)統(tǒng)計，約 80%的藥物含有堿性 官能團(tuán)，故堿性化合物的反相高效液相色譜（RPHPLC行為在色譜學(xué)界始終是一 個引人注目的研究課題，而具有不同 pKa值的堿性藥物的RPHPLC離在藥學(xué)界 的重要性正日益被關(guān)注 1。然而，由于堿性化合物的保留可隨著流動相pH值的不同而產(chǎn)生顯著的變化，因而它們的RPHPLC離通常具有一定的難度。在某些pH范圍內(nèi)，堿性化合物的色譜峰拖尾，表觀柱效（理論板數(shù)，n）較低，其原因可能包括色譜柱的過載、堿性化合物與填料表面殘余硅醇基的相互作用以 及較慢的吸附解吸附動力學(xué)

7、等。絕大多數(shù)抗生素同時含有堿性和酸性基團(tuán)，多 為親水性的兩性化合物，故其 RPHPL行為遠(yuǎn)較通常的堿性化合物更為復(fù)雜。我 們在應(yīng)用現(xiàn)行各國藥典24進(jìn)行抗生素RPHPL（分析時發(fā)現(xiàn)，有些抗生素的 色譜峰形異常峰形展寬并接近直角三角形，色譜峰的拖尾因子及峰寬均較 大，有時甚至影響到被測物與有關(guān)物質(zhì)間的分離。囿于目前的填料制造水平， 以硅膠為基質(zhì)的反相鍵合相填料的表面實際上是不均勻的，固定相中不可避免 地含有少量高能量位點 （sites） ，這些高能量位點易為可解離的 （甚至中性的 ）化合物所過載 (overloading) 5， 6。此外，解離的化合物在固定相表面的相互 排斥作用以及較難滲透進(jìn)入疏

8、水性的固定相中也是可能的原因7。眾多實驗結(jié)果已經(jīng)證實，在線性色譜(linear chromatography)領(lǐng)域，采用RPHPL分離可解離的(尤其是堿性的)化合物時色譜柱易于過載，甚至低達(dá) 10ng(相當(dāng)于10- 6,進(jìn)樣10卩l(xiāng))的堿性化合物也可使常規(guī)色譜柱(150mm<46mm的表觀柱效明顯 降低；減少進(jìn)樣量則可改善色譜峰形并使表觀柱效顯著增加；過載效應(yīng)可隨著 流動相的離子強(qiáng)度(c)的增加而逐漸減弱812。本課題選取了幾個具有代 表性的抗生素品種，初步研究了流動相的離子強(qiáng)度對RPHPL(中抗生素色譜峰形的影響。1儀器與試藥美國Agile nt 1100 型HPLC儀。色譜柱：頭抱呋

9、辛為美國Discovery C18(250mmX 46mm 5卩m),頭抱哌酮和青霉素 G為英 國 Hypersil BDS C18(250mm X 40mm 5 卩 m),克林霉素為日本 TSK GEL 0DS100S(150nXn46mm 5卩m)。頭抱呋辛鈉、頭抱哌酮鈉、頭抱哌酮 S異構(gòu) 體、頭抱哌酮降解物B、鹽酸克林霉素和青霉素 G鉀對照品均由中國藥品生物 制品檢定所提供。乙酸鈉、乙酸、氯化鈉、氫氧化鋰、氫氧化鉀、氨水、甲酸 鈉、甲酸、三乙胺、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨、磷酸和高氯酸鈉均為分析純，乙腈和甲醇均為HPLC級，水為蒸餾水。應(yīng)用 PeakMaster 5.1軟件(Charles大

10、 學(xué))計算流動相的離子強(qiáng)度。2 色譜條件和測定方法 流動相的組成以及供試品液的濃度見結(jié)果與討論；檢測波長：頭抱呋辛和頭抱哌酮為254nm，克林霉素為214nm青霉素G為220nm柱溫30C。流速：頭抱呋辛為15ml/min，頭抱哌酮為12ml/min，克林霉素和青霉素 G為10ml/min。進(jìn)樣體 積：頭抱呋辛為20卩l(xiāng)，頭抱哌酮、克林霉素和青霉素 G為10卩l(xiāng)。以流動相作 頭抱呋辛鈉、頭抱哌酮鈉和鹽酸克林霉素的溶劑，以水作青霉素G鉀的溶劑。3結(jié)果與討論已知在低pH值的流動相中，以所謂“B型”高純度硅膠為基質(zhì)的反相鍵合相填料的表面幾乎不存在離子化的硅醇基，這使得殘余硅醇基 對被測物的保留和過載

11、行為的影響極小 10， 11，故本課題主要采用這類金 屬殘留量極低、酸性硅醇基含量最少的惰性填料 Discovery C18 、 Hypersil BDS C18和 TSK GEL ODS100S 3.1頭抱呋辛中國藥典(ChP) 2a測定頭 抱呋辛鈉中頭抱呋辛含量的 RPHPL係統(tǒng)是參考美國藥典(USP)和英國藥典(BP)3a，4a制訂的，主要區(qū)別在于 ChP選用C18柱代替USP規(guī)定的己基硅烷鍵 合硅膠(C6)柱，而流動相則均為乙腈：pH34乙酸鹽緩沖液(含5mmol/L乙酸鈉 和01mol/L乙酸)(1 : 10)，頭抱呋辛(羧基的pKa值為25 13)在流動相中大 部分呈解離狀態(tài)并荷負(fù)

12、電。由于 ChP規(guī)定采用較大的進(jìn)樣量(05mg/ml，約 11mmol/L，20卩l(xiāng))，使頭抱呋辛峰具有典型的過載特征512，14峰形 接近直角三角形。隨著進(jìn)樣量的增加，色譜區(qū)帶中高濃度 (C) 的前半部的保留時 間(tR)相應(yīng)減少，但色譜區(qū)帶均在同一時刻結(jié)束(Fig.1A，Tab.1)。這種色譜峰 形在色譜學(xué)界通常稱之為過載拖尾 (overload tailing) 或非線性拖尾 (nonlinear tailing) 。過載使頭抱呋辛峰的拖尾因子 (T) 和峰寬均顯著增加， 頭抱呋辛與有關(guān)物質(zhì)間的分離也相應(yīng)變差。另選用其他C18柱(Kromasil C18、Zorbax C18、 Iner

13、tsil ODS3 、 Hypersil BDS C18 、 TSK GEL ODS100、S Shimpack CLCODS口 LiChrospher 100 RP18e)、C8柱(Kromasil C8、Inertsil C83 Hypersil BDS C8、Shimpack CLCC8 TSK GEL C8和 Discovery C8)和 C4 柱(SinoChrom C4)實驗，結(jié)果也如此。如選用 C6柱則可得最為對稱的色譜峰形 15，且頭抱呋辛峰無過載特征 (Fig.1B) 。國內(nèi)另有研究表明，頭抱呋辛的 峰形與填料的品牌也即填料的制造工藝有關(guān)，選用某些品牌的填料如Spheriso

14、rb C18 可得較為對稱的峰形 16，在我們的實驗中也得到證實。由 此可見，雖然所用流動相的緩沖容量較低（乙酸的pKa值約為47 17a），但 頭孢呋辛在大多數(shù)類型的色譜柱上易于過載并非由于緩沖液過載 （buffer overload） 所致，而可能源于這類色譜柱對離子化的化合物的飽和容量相對較 低。Fig.1 （略）最近的研究結(jié)果712, 1827顯示，應(yīng)用RPHPL（分離可解 離的化合物時，流動相中添加緩沖鹽并非僅僅用于穩(wěn)定流動相的pH值，緩沖鹽、甚至簡單的中性鹽的反離子還可與離子化的被測物通過相互間的締合作用 形成疏水性較強(qiáng)的中性離子對復(fù)合物；在低離子強(qiáng)度的緩沖液中，吸附在固定 相表面

15、的離子化的被測物分子的極性基團(tuán)相互之間存在靜電排斥效應(yīng)，這使得 色譜柱的飽和容量顯著降低；隨著緩沖液濃度（離子強(qiáng)度）的增加，中性離子對復(fù)合物的濃度相應(yīng)增加，固定相表面離子化的吸附物之間的相互排斥作用隨之 減弱，導(dǎo)致色譜柱的飽和容量、尤其是填料上的低能量位點（與溶質(zhì)和鍵合相的烷基鏈之間的相互擴(kuò)散作用有關(guān) ）的飽和容量以及平衡常數(shù)增加；鹽一類的流動 相添加劑可破壞離子化的被測物在流動相中的溶劑化去溶劑化平衡，產(chǎn)生所謂 的促溶效應(yīng) （chaotropic effect） ，被測物與鹽相互作用，離子化的被測物相互 間的排斥作用減弱，從而顯著地影響被測物在固定相上的吸附行為；在制備色 譜系統(tǒng)中或被測物濃

16、度較高時，流動相中應(yīng)含有足量的緩沖鹽以改善色譜峰形 和分離效果。根據(jù)文獻(xiàn) 812， 1827，在流動相中添加中性鹽如氯化鈉或 增加緩沖液的濃度 （均使離子強(qiáng)度增加 ）后，頭孢呋辛的峰形顯著改善，拖尾因 子降低，表觀柱效增加，其保留時間受進(jìn)樣量的影響變小，且緩沖液的濃度越 高，效果越明顯。有研究表明，色譜柱的飽和容量可隨緩沖鹽的單價陽離子（如Na 、K 、Cs ） 直徑的增加而降低 18，故分別以 NH 4、K 、Li 代替 Na 進(jìn) 行了實驗。選用 Na ，色譜柱的飽和容量相對較高。流動相中如含10%乙腈，則乙酸的pKa值可由47增至49 2830;流動相的表觀pH值通?？呻S著乙腈 濃度的增加

17、而相應(yīng)增加，且表觀 pH值的變化與緩沖鹽的種類、濃度以及最初的 pH值等均相關(guān)28, 29。顯然，現(xiàn)行藥典的流動相的緩沖容量較低，流動相 中的乙酸只有極少量以解離的形式存在，如欲增加緩沖液的濃度，則緩沖液中 需添加高濃度的乙酸，這使得乙酸可能作為強(qiáng)洗脫劑成分，改變色譜系統(tǒng)的選 擇性。因此，緩沖鹽改用與乙酸性質(zhì)類似但更為適宜的甲酸鹽（pKa值約為3717b），同時流動相進(jìn)一步優(yōu)化為乙腈：pH34甲酸鹽緩沖液（含80mmol/L甲 酸鈉和014mol/L甲酸）（1 : 9），則可得較好的色譜峰形（Fig.1C）。另用其他 C18柱（Kromasil C18、Hypersil BDS C18 和 T

18、SK GEL ODS100球驗，亦可得 顯著改善的色譜峰形。眾所周知，保留值（如容量因子k）反映了被測物在固定 相和流動相中的量之比，故過載行為對保留值較大的組分更易于發(fā)生11。實驗結(jié)果也證實，隨著流動相中乙腈濃度的增加，頭孢呋辛的保留時間減少， 色譜峰的對稱性進(jìn)一步改善 （乙腈濃度為 15%時，理論板數(shù)不增反降則是由于保 留時間較少時，表觀柱效受柱前死體積的影響相對較大所致 ）。3.2 頭孢哌酮ChP2b測定頭抱哌酮鈉中頭抱哌酮含量的RPHPL系統(tǒng)是參考USP3b制訂的，ChP和USP的流動相均為乙腈：pH44乙酸鹽緩沖液（含 12mmol/L三乙胺和4mmol/L乙酸）（12 : 88）;

19、 BP 4b的流動相為乙腈：pH44 乙酸鹽緩沖液（含25mmol/L三乙胺和6mmol/L乙酸）（11 : 89）。 ChP采用較大的 進(jìn)樣量（05mg/ml，約07mmol/L, 10卩l(xiāng)），頭抱哌酮及其S異構(gòu)體的色譜峰均具 有典型的過載特征，降解物B(中性化合物)的峰形則非常對稱(Fig.2A)。另選 用其他 C18柱(Kromasil C18、Inertsil ODS3 、TSK GEL ODS100和LiChrospher 100 RP18e)實驗，結(jié)果也如此。國內(nèi)許多實驗室證實，ChP方法對色譜柱的要求比較苛刻，即使降低進(jìn)樣量也僅有少數(shù)品牌的色譜柱符合國外 藥典對系統(tǒng)適用性的要求(

20、USP T< 15, BP: n5000);選用BP流動相則色譜 柱的選擇范圍相對較寬；ChP色譜系統(tǒng)的平衡所需時間較長；采用某些品牌的 色譜柱，頭孢哌酮的保留時間的重現(xiàn)性較差;選用不同品牌的填料，頭孢哌酮 及其主要雜質(zhì)的洗脫順序可能不同。三乙胺在HPLC早期主要作為掃尾劑以改善色譜峰形，隨著最近十多年來填料制造工藝的改進(jìn)以及所謂惰性填料的廣泛應(yīng) 用，三乙胺在現(xiàn)代HPLC中已很少采用。三乙胺在 ChP色譜系統(tǒng)中還可作為疏水 性較弱的離子對試劑影響頭孢哌酮的保留，隨著流動相中三乙胺濃度的增加， 頭孢哌酮的保留時間相應(yīng)減少 31。流動相中離子對試劑的濃度一般應(yīng)不低 于5mmol/L，否則色譜

21、系統(tǒng)的平衡所需時間較長，且離子化的化合物的保留值 的重現(xiàn)性可能較差。采用無緩沖液或緩沖容量極低的流動相時，可解離的化合 物的色譜峰可隨著進(jìn)樣量的增加而展寬甚至裂分21，3234。在含12%- 18%乙腈的流動相中，乙酸的pKa值由47增至約51 2830。顯然，ChP色 譜系統(tǒng)的緩沖容量極低，緩沖液的濃度與供試品液的濃度接近，較高濃度的供 試品液進(jìn)入色譜系統(tǒng)后，頭孢哌酮在流動相中的二次化學(xué)平衡會導(dǎo)致色譜區(qū)帶 處的流動相pH值發(fā)生微小變化，影響頭抱哌酮的可解離基團(tuán)的離子化，即頭抱 哌酮在色譜區(qū)帶的每一點處的離子化程度取決于其本身的濃度，而頭孢哌酮的 不同離子化形式的保留是不同的，結(jié)果導(dǎo)致緩沖液過

22、載 7頭抱哌酮峰展 寬，保留值重現(xiàn)性差。如采用 1/10 的進(jìn)樣量，則頭抱哌酮的峰形顯著改善，但 仍呈現(xiàn)過載特征，仍較難符合國外藥典的要求。在流動相中添加中性鹽后，頭 抱哌酮的峰形顯著改善，拖尾因子和峰寬均降低，其保留時間受進(jìn)樣量的影響 變小，且鹽的濃度越高，效果越明顯。參考ChP2005和文獻(xiàn)31，將乙酸鹽緩沖液的pH值降至30,雖然離子強(qiáng)度僅稍增加，但頭抱哌酮的峰形顯著改 善，只是仍稍具過載特征 (Fig.2B) 。這是因為在含有乙腈的流動相中，化合物 的酸性基團(tuán)的pKa值會隨著乙腈濃度的增加而相應(yīng)增加30，31，故pH30 時，頭抱哌酮的羧基pKa值為 23( 01 03.htm) 在流

23、動相中的解離被抑制，吸附在固定相表面的、羧基解離的頭抱哌 酮分子顯著減少，頭抱哌酮分子相互間的靜電排斥效應(yīng)相應(yīng)降低，使色譜柱的 容量、表觀柱效以及頭抱哌酮的保留時間均隨之增加。鑒于ChP2005流動相的緩沖容量仍較低，流動相中的乙酸只有極少量以解離的形式存在，故緩沖鹽改 用更為適宜的甲酸鹽，同時棄用會使保留機(jī)理復(fù)雜化的三乙胺，選用乙 腈：pH30甲酸鹽緩沖液(含40mmol/L甲酸鈉和018mol/L甲酸)(18 : 82)為流動 相時，可得較好的色譜峰形和分離效果 (Fig.2C) ；隨著緩沖液濃度的進(jìn)一步增 加，色譜峰形進(jìn)一步改善；甚至進(jìn)樣量增加 1 倍，也未見拖尾因子和峰寬有顯 著的增加

24、。另用其他 C18柱(Kromasil C18、LiChrospher 100 RP18e、 Discovery C18、Hypersil BDS C18 和 TSK GEL ODS100S)驗，亦可得顯著改 善的色譜峰形和分離效果。但值得注意并令人困惑的是，僅僅將乙酸鹽緩沖液 的pH值降至30并添加約16mmol/L NaCl，卻可得最佳的色譜峰形。Fig.2 (略)3.3 克林霉素 C h P 2 c 測定鹽酸克林霉素中克林霉素含量的RPHPL(系統(tǒng)與BP和USP3b，4b不同，ChP的流動相為甲醇：pH30磷酸鹽緩沖液(含25mmol/L磷酸二氫銨4mmol/L磷酸)(45 : 55),

25、 BP和USP的流動相為 乙腈：pH75磷酸鹽緩沖液(含50mmol/L磷酸二氫鉀和40mmol/L氫氧化 鉀)(42 : 58)。 ChP采用與BP相同的進(jìn)樣量，但克林霉素峰具有典型的過載特 征(Fig.3A)。另選用其他 C18柱(Kromasil C18、Inertsil ODS3 、Hypersil BDS C18 Discovery C18、Shimpack CLCODS口 LiChrospher 100 RP18e)實 驗，結(jié)果也如此。如選用BP的色譜系統(tǒng)，則克林霉素的峰形較為對稱，表觀柱 效亦較高(Fig.3B)。參考BP的色譜系統(tǒng)，以甲醇代替乙腈，并適當(dāng)增加甲醇的 濃度以使克林

26、霉素具有幾乎相同的保留時間，則流動相的離子強(qiáng)度減半，拖尾 因子和峰寬僅稍增加；在 ChP的流動相中添加中性鹽或緩沖液濃度增加1倍，拖尾因子顯著降低，但表觀柱效亦相應(yīng)降低；如流動相的緩沖液濃度增加 4 倍，則峰形明顯改善，拖尾因子和峰寬均降低，但色譜峰仍具有過載的特征 (Fig.3C) ；如緩沖液濃度增加 4倍并以乙腈代替甲醇，同時適當(dāng)減少乙腈的濃 度，流動相的離子強(qiáng)度增加近 6 倍，但峰形卻未見顯著改善。上述實驗結(jié)果表 明，克林霉素在固定相上的過載不僅僅與流動相的離子強(qiáng)度有關(guān)。在低pH值的流動相中，反相色譜柱易于為質(zhì)子化的堿性化合物所過載；在色譜柱均過載的 情形下，采用低pH值(pH23)流動

27、相所得的色譜峰形明顯不同于采用高pH值(pH7)流動相所得的色譜峰形，后者的峰形更復(fù)雜，后者同時還具有明顯的指數(shù) 拖尾(exponential tailing)也即動力學(xué)拖尾(kinetic tailing)的特征，提示在高pH值時除疏水相互作用外，還存在離子交換的相互作用11;填料表面 在高pH值流動相中出現(xiàn)陽離子交換位點，相應(yīng)地增加了色譜柱的容量；流動相 中反離子的化合價較高時(如BP流動相中的H2PO2-4之于ChP流動相中的 H2PO-4),反離子可與一個以上的有機(jī)離子形成中性離子對復(fù)合物24，相應(yīng)地減少了吸附在固定相表面的克林霉素分子及其相互間的靜電排斥效應(yīng)，增加 色譜柱的飽和容量。

28、此外，流動相中選用不同的有機(jī)溶劑，有可能影響固定相 的構(gòu)象以及被測物在固定相表面的吸附和分配，導(dǎo)致不同的色譜峰形。由于在 含有乙腈或甲醇的流動相中，堿性化合物的pKa值通常可隨著有機(jī)溶劑濃度的增加而逐漸降低30，35，故克林霉素(pKa值為76 36)在BP流動相中只 有少量以質(zhì)子化的形式存在，因而吸附在固定相表面的離子化的克林霉素分子 極少，克林霉素分子相互間的靜電排斥效應(yīng)較小，這使得色譜柱的飽和容量較 高；克林霉素在ChP流動相中則全部是以質(zhì)子化的形式存在的，故吸附在固定 相表面的克林霉素分子均以離子化的形式存在，其相互間的靜電排斥效應(yīng)較 大，致使色譜柱的飽和容量相應(yīng)較低。磷酸鹽 (磷酸的

29、pKa值為22，71，12315c)在ChP流動相中主要以H2PO-4的形式存在。流動相中緩沖鹽的種類不 同，則色譜柱的飽和容量、色譜峰形以及表觀柱效等均不相同 9， 10， 27； 流動相中選用不同種類的無機(jī)反離子，質(zhì)子化的堿性化合物峰的理論板數(shù)和拖 尾因子均顯著不同，在已測試的四種反離子中，使拖尾因子降低、表觀柱效增 加的趨勢如下：六氟磷酸根(PF-6) 高氯酸根(ClO-4) 四硼磷酸根(BF-4) H2PO-427。向ChP流動相的緩沖液中添加 01mol/L NaClO4，雖然流動相的 離子強(qiáng)度僅增加 3 倍，但克林霉素峰的拖尾因子顯著降低，表觀柱效和保留時 間亦顯著增加，唯克林霉素

30、與緊鄰的未知雜質(zhì)的分離度并未如預(yù)計地顯著增 加，提示高濃度的 ClO-4 在該流動相中可能作為對離子改變了色譜系統(tǒng)的選擇 性。Fig.3 (略)3.4青霉素GUSH4d測定青霉素 G鉀中青霉素G含量的RPHPL係統(tǒng)與BP3d不同，USP的流動相為甲醇：10mmol/L磷酸二氫鉀溶液(40 : 60), BP的流動相則為甲醇：pH35磷酸鹽緩沖液 (80mmol/L磷酸二氫鉀3mmol/L磷酸)(35 : 65)。 USP的進(jìn)樣量是BP的進(jìn)樣量 的1/20，選用USP的流動相和進(jìn)樣量，青霉素 G峰形比較對稱，增加進(jìn)樣量則 峰形具有過載的特征(Fig.4A)。另選用其他 C18柱(Kromasil

31、 C18、Inertsil ODS卸TSK GEL ODS100實驗，結(jié)果也如此。改用 BP的流動相，青霉素 G峰 形對稱且?guī)缀醪皇苓M(jìn)樣量大小的影響。如將USP的流動相中的磷酸二氫鉀濃度增至50mmol/L，同時甲醇濃度增至50%則峰形顯著改善，但仍稍具過載特征 (Fig.4B);繼用磷酸調(diào)節(jié)磷酸二氫鉀溶液的 pH值至35,則峰形進(jìn)一步改善 (Fig.4C) 。 USP流動相中的磷酸二氫鉀溶液(pH43)非緩沖液，實為幾無緩沖容 量的鹽溶液，易導(dǎo)致緩沖液過載7,如進(jìn)樣量較大則難以控制青霉素 G在流 動相中的解離即二次化學(xué)平衡，且流動相的離子強(qiáng)度較低，故色譜峰形隨著進(jìn) 樣量的增加而顯著展寬 (F

32、ig.4A) 。將流動相中磷酸二氫鉀的濃度增至 50mmol/L，增加了流動相的緩沖容量和離子強(qiáng)度，色譜峰形相應(yīng)改善 (Fig.4B);進(jìn)一步調(diào)節(jié)磷酸二氫鉀溶液的pH值至35,則流動相的緩沖容量顯 著增加，且由于在含有乙腈的流動相中，化合物酸性基團(tuán)的pKa值隨著乙腈濃度的增加而逐漸增加29, 34，故青霉素G的羧基pKa值為 27(/pdf/veterinary/penicillinGin.pdf)在流動相中的解離被抑制，相應(yīng)地減少了吸附在固定相表面的離子化的青霉素 G分子及其相 互間的靜電排斥效應(yīng)，使色譜柱的容量、表觀柱效以及青霉素G的保留時間均相應(yīng)增加，青

33、霉素G在色譜過程中呈現(xiàn)出類似于中性化合物的色譜行為和色譜 峰形(Fig.4C)。類似的例子還有頭抱噻吩：ChP 2d測定噻吩鈉中頭抱噻吩含 量的RPHPL(系統(tǒng)與BP和USP3e，4e不同，ChP的流動相為乙腈：165mmol/L乙酸溶液(pH28)(1 : 3)，離子強(qiáng)度僅為13mmol/L，進(jìn)樣量較大 (05mg/ml，12mmol/L，10卩l(xiāng))，故頭抱噻吩峰具有典型的過載特征；BP和 USP的流動相為乙腈：乙醇：pH59乙酸鹽緩沖液(含260mmol/L乙酸鈉和15mmol/L 乙酸)(15 : 7 : 79)，離子強(qiáng)度高達(dá) 205mmol/L，雖進(jìn)樣量更大(1mg/ml，10卩l(xiāng))，

34、但頭抱噻吩的峰形較為對稱，表觀柱效亦較高(圖略)。頭抱西?。?BP和USP 3f，4f的流動相分別為水：乙腈：乙酸(81 : 19 : 1)和水：乙腈：乙 酸(84 : 16 ： 1)，離子強(qiáng)度僅為18mmol/L，緩沖容量較低(84mmol/L)，進(jìn)樣量 較大(BP: 1mg/ml，22mmol/L, 20 卩 l ; USP 03mg/ml, 07mmol/L，10 卩 l)，頭 抱西丁峰具有典型的過載特征。頭抱米諾：日抗基 37的含量測定用流動相 為：175mmol/L乙酸溶液(pH28):甲醇：四氫呋喃(990 : 5 : 5)，離子強(qiáng)度僅為 18mmol/L，且乙酸溶液實為幾無緩沖容

35、量的鹽溶液(緩沖容量為84mmol/L)，進(jìn) 樣量較大(5mg/ml, 106mmol/L, 5卩l(xiāng))，故頭抱米諾峰具有典型的過載特征。哌 拉西林：ChP2e的含量測定用流動相為含10mmol/L磷酸二氫鈉和2mmol/L 氫氧化四乙基銨的甲醇：水(4 : 6)(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至55)，離子強(qiáng)度亦較 低，約為12mmol/L,哌拉西林峰具有典型的過載特征。萬古霉素：BP和USP3g, 4g的有關(guān)物質(zhì)檢查用流動相為14mmol/L磷酸三乙胺緩沖液(pH32):乙 腈：四氫呋喃(92 : 7 : 1)，離子強(qiáng)度低至14mmol/L,萬古霉素B峰亦具有過載 的特征。Fig.4 (略)參考文獻(xiàn) 1

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