蛋白相互作用Pull-Down試驗

1、蛋白相互作用Pull-Down實驗實驗原理：Pull-Down技術是通過蛋白相互作用來研究細胞通路的有力工具。是 確定兩種或更多蛋白之間相互作用的體外方法。Pull-Down實驗可用來檢測已知 的蛋白相互作用條件，并且可用來篩選未知的蛋白相互作用。用作誘餌的蛋白是重組蛋白，會含有一個用于純化的親和標簽。這個融合標 簽就是用于Pull-Down實驗的基礎。最常見的標簽為谷胱甘肽 S-轉移酶（GST 和多組氨酸（6X His ）。其分別使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金屬螯合物親2+2+和配體（如Ni和Co ） oPtiase 1In vitro Proy Protein Synlhosis(TNT

2、*T7SySl«n)PhasB 2Immobilization of Bair tG ST-fusion)Protein onto MagneGST Panidesproy prntGin detociedWashWashEluteJ|gst|-C + QFigure 1 Overview of the MjgneGST Pull-Down System protocol P h Prey Protein, M = MagneGST PjtftKk.實驗準備：實驗儀器：谷胱甘肽瓊脂糖凝膠（鎳離子瓊脂糖凝膠） 、離心機、 實驗材料：表達的含標簽的純化蛋白、細胞裂解液實驗試劑： Bind

3、ing Buffer/Washing Buffer: Na 2HPO4、2mMKH2PO4、140mMNaCl、10mM KClSDSloading Buffer: 50mMTris-Cl 、2%SD、S %溴酚藍、 10%甘油、 10mMDTT裂解緩沖液： 20mMTris-Cl 、 200mM NaCl、 1mM EDTA（）、%Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制劑。 （蛋白酶抑制劑： 2ug/ul 抑肽酶（ aprotinin ）、 1ug/ul 白胃素（ leupeptin ）、ml 胃酶抑素（ pepstatin ）、 25ug/ml 苯甲磺酰氟（ PMSF） 實驗方

4、法： 方法一：1、預清除細胞裂解液：將細胞裂解液與50ul的50%?胱甘肽瓊脂糖球珠懸液和25ug GST在 4C混合 孵育 2h。離心機12,000g在4°C離心2min。 將上清轉移至新的離心管中。2、探測細胞裂解液 兩個含等量預清除細胞裂解液及 50ul ?胱甘肽瓊脂糖球珠的微量離心管。 在 一管中加約10ug的GST蛋白，另一管中加約10ug的GST融合探針蛋白。兩 個反應中加入的探針和對照蛋白質的量應該是等摩爾的。將離心管在4C翻轉混合孵育 2h。最大速度在4C離心樣品2min。 在新的微量離心管中收集上清。 用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在離心機上以最大速度離心1ml。棄去

5、上清。重復洗三次。加入50ul 20mmol/L的還原型谷胱甘肽到球珠中，洗脫 GST融合蛋白及任何 與其結合的蛋白質。在離心機上最大速度離心 2min。將洗脫蛋白質與等體積的2X SDS-PAG上樣buffer混合3、檢測相互作用蛋白質將樣品煮沸4min,進行SDS-PAG凝膠電泳分析。方法二：1、5ug目的GST融合探針蛋白和GST蛋白分別和谷胱甘肽瓊脂糖凝膠球珠在4 C孵育結合30min。2、 結合GST融合探針蛋白的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠球珠與100ul細胞裂解液結 合在4 C作用4h。3、3000rpm在4C離心5min,除去上清。4、 用洗滌緩沖液重懸谷胱甘肽瓊脂糖凝膠球珠，3000r

6、pm在4C離心5min, 除去上清,重復 5 次。5、取谷胱甘肽瓊脂糖凝膠球珠進行 SDS-PAG電泳分析。方法三：實驗試劑： PBS(140mM NaC、l KCl、 10mM N2aH PO4 、 KH2PO4)Elutio n Buffer: 50mM Tris-CI、10mM還原型谷胱甘肽0.154g 溶解到 50ml 50mM Tris-Cl 中配制 Elution Buffer 。1 、細胞裂解取 1ml 細菌培養(yǎng)液離心去上清, 加 200ul 細胞裂解液到菌丸, 在室溫下重 懸并輕柔的混勻。將其在室溫下晃動孵育 20-30min。2、固定GST融合蛋白到柱子上將谷胱甘肽瓊脂糖凝膠

7、顛倒混勻后取 20ul 到離心管中, 小心去除上清, 加 250ul Binding Buffer 或 wash Buffer 到凝膠中,混勻。重復洗 3 次以上。平衡好的凝膠用 100ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重懸。加 200ul 含GST融合蛋白的細菌裂解液，在旋轉的臺子上室溫下孵育30min。小心移去上清,(保存以便分析,)將 250ul Binding Buffer 或 washBuffer 加到凝膠中, 輕柔混勻, 在室溫下孵育 5min。 小心移去上清。 加入 250ulBinding Buffer 或 Washing Buffer 再次清洗,

8、將凝膠用 20ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重懸。3、捕獲獵物蛋白將5ul固定GST融合蛋白的凝膠中加入20ul含獵物蛋白的溶液，將155ul Bin di ng Buffer 或wash Buffer和20ul 10%BSA加入凝膠中，在室溫下旋轉 孵育1h。移去上清。將 400ul Binding Buffer 或 wash Buffer 加入凝膠中，輕柔混勻，在室溫 下孵育5min，移去上清。加 400ul Binding Buffer 或wash Buffer再次清 洗凝膠。小心移去上清。分析：加20ul SDS-PAGEoading Buffer，在

9、室溫下混合 5min。取出上清用 于分析。His Pull-Down 方法實驗試劑：Binding Buffer: 20mM Tris-Cl 、150mM NaCJ 20mM咪唑Elution Buffer: 20mM Tris-Cl 、300mM NaC、500mM咪唑實驗步驟：I 、結合蛋白裂解后，經濾膜過濾，2、與Ni-NTA樹脂（1ml蛋白裂解液上清結合5ul樹脂）4C混合孵育3h3、待樹脂沉淀后用 10倍柱體積的鎳柱洗滌緩沖液洗去雜蛋白。4、用 6 倍柱體積鎳柱洗脫目的蛋白。5、純化后的蛋白用PBS和超純水透析，凍干。6、SDS-PAG電泳分析7、純化的蛋白與Ni-NTA樹脂冰浴作用

10、2h，8、10 倍柱體積洗滌緩沖液洗滌，9、然后加入過量 100ug/ml 蛋白溶液，冰浴作用 2h，10、用 10 倍柱體積的鎳柱洗滌緩沖液清洗，II 、加入 1 倍柱體積洗脫緩沖液洗脫，12、洗脫蛋白進行SDS-PAGE口 Western-blot分析鑒定。13、陰性對照為結合蛋白溶液加入 Ni-NTA樹脂中冰浴作用2h。10倍柱體積的鎳柱洗滌緩沖液清洗，加入 1 倍柱體積洗脫緩沖液洗脫，注意事項：1、所有過柱的液體都要經過或的濾膜。2、平衡柱子：用 3-5 個柱體積蒸餾水洗柱用 3-5 個柱體積的 binding buffer 平衡柱子。3、洗柱： 如谷胱甘肽瓊脂糖凝膠的柱子失去結合能力，需要洗去柱子上的雜質3.1除去變性物質，用2個柱體積的的6M鹽酸胍洗柱子，然后用5個柱體積 的PBS洗柱3.2除去疏水