熒光定量PCR儀的操作快速指南

1、iCycler 熒光定量PCR儀的操作快速指南1. 接通iCycler的電源，實(shí)驗(yàn)前先讓系統(tǒng)預(yù)熱30分鐘。打開(kāi)電腦，啟動(dòng)iCycler的軟件，并點(diǎn)擊Yes和OK注冊(cè)登陸。2. 在0.2ml的薄壁PCR反應(yīng)管內(nèi)加入PCR反應(yīng)試劑和待測(cè)樣本，并蓋上蓋子。（若使用96孔板，則用光學(xué)級(jí)封帶封口），注意，必須帶一次性塑料手套，不要讓手指接觸到反應(yīng)管表面。將反應(yīng)管按順序放入儀器的加熱孔中。3. 點(diǎn)擊軟件Protocol Workshop功能模塊，設(shè)置PCR熱循環(huán)的程序（thermal protocol），包括溫度、時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等參數(shù)的設(shè)置。熱循環(huán)設(shè)置完后，必須選擇在哪一步驟進(jìn)行熒光采集。雙擊下圖中的圖標(biāo)

2、，看到黃燈并有“REAL-TIME“出現(xiàn)，表明儀器在該步驟實(shí)時(shí)采集和分析熒光信號(hào)。4. 在Protocol Workshop模塊中，點(diǎn)擊上方“Edit Plate Setup”，設(shè)置反應(yīng)板文件。（1） 首先在窗口的96孔模擬布局圖中選擇本次實(shí)驗(yàn)使用哪些孔、及對(duì)應(yīng)的樣品類(lèi)型（sample type）。如果樣品類(lèi)型是標(biāo)準(zhǔn)品的話(huà)，還要輸入其對(duì)應(yīng)的量。（2） 點(diǎn)擊“Select and Load Fluorophores”， 設(shè)置樣品的熒光基團(tuán)種類(lèi)（3） 全部設(shè)置完成后，可點(diǎn)擊“View Quantities/Identities”進(jìn)行確認(rèn)。然后點(diǎn)擊右上角run with selected proto

3、col，系統(tǒng)自動(dòng)切換到 “Run Prep”窗口。5. 在“Run Prep”窗口，用戶(hù)首先確認(rèn)PCR熱循環(huán)文件和反應(yīng)板設(shè)置文件是否正確。然后：（1） 在“Sample volume is”文件框中輸入反應(yīng)體系的體積（2） 在“Identify Protocol Analysis”中選擇PCR定量/熔點(diǎn)曲線(xiàn)（PCR Quantification/ Melt Curve）；（3） 在“Select Well Factor Source”中選擇使用正確的反應(yīng)板矯正方式。A：如果PCR反應(yīng)采用Taqman或Molecular Beacon等探針，且每個(gè)孔中探針的濃度都一樣， 則選擇“Experime

4、ntal Plate”B：如果PCR反應(yīng)采用SYBR Green I等DNA結(jié)合染料，則需在PCR反應(yīng)液中加入一定濃度的熒光素（隨機(jī)帶Cat No. 1708780，詳細(xì)操作參見(jiàn)附件一），然后選擇“Experimental Plate”方式C：或采用“External Well Factor Plate”（詳細(xì)操作參見(jiàn)見(jiàn)附件一） （4） 點(diǎn)擊“Begin Run”鍵。6. 給本次的數(shù)據(jù)記錄文件（opd文件）起名。7. PCR循環(huán)開(kāi)始后，系統(tǒng)會(huì)打開(kāi)Run-Time Central模塊對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到熒光收集循環(huán)時(shí)，Data Analysis模塊會(huì)自動(dòng)打開(kāi)，進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集和分析。8. PCR反應(yīng)結(jié)束后，在PCR Quantification窗口的“Select Analysis Mode”文件框中選擇“PCR Base Line Subtracted” 或“PCR Base Line Subtracted Curve Fit”模式選項(xiàng)可得到各樣品的Ct值。點(diǎn)擊窗口上方的“PCR Standard Curve”切換進(jìn)入PCR Standard Curve窗口，可得到本次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖下方的表格中顯示著與其相關(guān)的數(shù)據(jù)，內(nèi)容包括樣品序號(hào)、樣品類(lèi)型（Type）、Ct值（Threshold Cycle）、起始模板量（St