熒光光譜法研究左氧氟沙星與酪蛋白的相互作用_張青

1、熒光光譜法研究左氧氟沙星與酪蛋白的相互作用#張青，徐群為，黃長高，都述虎（南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南京市210029）中圖分類號R969.2；R978.1；R977.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1001-0408（2011）25-2333-03摘要目的：研究左氧氟沙星與酪蛋白的相互作用，為制備以酪蛋白為載體的左氧氟沙星新型藥物傳輸系統(tǒng)提供依據(jù)。方法：應(yīng)用熒光光譜技術(shù)研究了各組分的熒光發(fā)射光譜；并且在不同溫度下（25、30）進(jìn)行了2組分相互作用的猝滅試驗，計算得到相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)和結(jié)合常數(shù)等。結(jié)果：左氧氟沙星對酪蛋白的內(nèi)源性熒光有較強的猝滅作用；推斷猝滅機制為靜態(tài)猝滅；計算得4141到靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)為2.

2、83×10L·mol（25）和2.17×10L·mol（30），平均結(jié)合位點數(shù)為1.38。結(jié)論：左氧氟沙星與酪蛋白2種分子以接近11的比例，通過氫鍵和范德華力發(fā)生相互作用；本研究為制備以酪蛋白為載體的左氧氟沙星傳輸系統(tǒng)提供了藥載比等相關(guān)信息。關(guān)鍵詞左氧氟沙星；酪蛋白；相互作用；熒光猝滅；熱力學(xué)參數(shù)StudyontheInteractionbetweenLevofloxacinandCaseinbyFluorescenceMethodZHANGQing，XUQun-wei，HUANGChang-gao，DUShu-hu（SchoolofPharmacy，N

3、anjingMedicalUniversi-ty，Nanjing210029，China）KEYWORDSLevofloxacin；Casein；Interaction；Fluorescencequenching；Thermodynamicparameters左氧氟沙星（LOFL）為氧氟沙星的左旋活性異構(gòu)體，屬第3代氟喹諾酮類廣譜抗菌藥物，通過抑制細(xì)菌DNA回旋酶，對大多數(shù)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有顯著的殺菌作用，對非1典型病原體也有較好的抗菌作用。目前，LOFL遞藥系統(tǒng)主要有普通注射劑、滴眼劑、片劑和膠囊劑，但這些劑型的缺陷是藥物進(jìn)入體內(nèi)后消除較快，而緩釋制劑比普通制劑能更長時間維持LOFL

4、的有效濃度，所以很多學(xué)者在研究LOFL的緩2，3釋劑型。酪蛋白（Cas）是主要從牛奶中提取的一種混合蛋白質(zhì)，根據(jù)編碼基因不同，分為s1、s2、4種組分4，其質(zhì)量比為4141，平均等電點為4.8，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于食品、化妝品的處方5中，具有高乳化性、穩(wěn)定性、膠凝性及生物相容性6。因為Cas具有親水和親脂的氨基酸殘基，所以在溶液中能自發(fā)組裝成7膠束，并且其可以與戊二醛發(fā)生交聯(lián)，形成生物可降解的、具8有緩控釋能力的微球。以Cas為載體材料制備的藥物傳輸系統(tǒng)，不僅具有生物可降解性，而且具有藥物緩控釋能力，有良8，9好的研究前景。本文通過熒光光譜技術(shù)，研究LOFL與Cas的相互作用，推斷其作用機制，計算

5、得到結(jié)合常數(shù)和相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)。本研究可為制備以Cas為載體材料的LOFL遞藥系統(tǒng)提供緩釋機制、藥物載體比例、穩(wěn)定性等方面的理論基礎(chǔ)。南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金重點項目（08NMUZ012）1.1儀器與試藥儀器F4600型熒光光度計（日本Hitachi公司）；Delta320-SpH計（瑞士Mettler-Toledo公司）；AY220型電子天平（日本Shi-madzu公司）；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備TM有限公司）；PURELABCLASSIC超純水機（德國Pall公司）。1.2試藥LOFL（乳酸鹽，上海三維制藥有限公司，批號：200510124，純度：99）；Cas（酪蛋白

6、酸鈉，百靈威科技有限公司，批號：C0594，純度：90）；所有樣品溶液均用氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子1強度為0.1mol·L；試劑均為分析純，試驗用水為超純水。22.1方法熒光光譜的研究為了考察研究對象的熒光發(fā)射光譜是否相互干擾，記錄了各單一組分的熒光發(fā)射光譜。在緩沖液（三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，Tris-HCl）中160W功率下超聲10min，溶解Cas，制備14成2g·L的貯備液；LOFL在緩沖液中制備成1.0×10mol·1L的貯備液，均置于冰箱中14保存。取Cas貯備液1mL和LOFL貯備液0.5mL，分別置于10mL容量瓶中，用緩沖液定容，搖勻，掃描熒光

7、光譜。預(yù)試驗測得LOFL和Cas的激發(fā)/發(fā)射波長分別為285/461nm和278/340nm。設(shè)定激發(fā)波長為285nm，掃描發(fā)射波長范圍295700nm，掃描速度為12001nm·min，激發(fā)和發(fā)射光狹縫寬度分別為10nm和5nm，光電1倍增管（PMT）電壓為400V，記錄0.2g·L的Cas溶液、5×105mol·L1的LOFL溶液和緩沖液的熒光光譜。2.2熒光猝滅試驗熒光猝滅試驗可以推斷分子間相互作用的機制，計算相Pharmacy2011Vol.22·2333·互作用的熱力學(xué)參數(shù)以及分子結(jié)合位點數(shù)1012。在編號為08號的10mL

8、的容量瓶中，均加入1.0mL的Cas貯備液，然后分別加入0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL的LOFL貯備液，用pH7.4的緩沖液稀釋至刻度，混合均勻，于恒溫水浴鍋中保溫1h，得到08號樣品。其中Cas濃度均為0.2g·1555L，LOFL濃度分別為0、0.2×10、0.3×10、0.4×10、0.5×55555110、0.6×10、0.7×10、0.8×10、0.9×10mol·L。分別在25和302種溫度下記錄各樣品的熒光光譜。從熒光光譜中可以得到在不含或含

9、不同濃度的LOFL情況下，Cas在最大發(fā)射波長處的熒光強度。熒光猝滅的機制分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅是熒光分子在擴散中遭遇猝滅劑而發(fā)生的碰撞猝滅；靜態(tài)猝滅是熒光分子與猝滅劑之間形成了基態(tài)復(fù)合物引起的熒光猝滅12。如果猝滅機制是動態(tài)猝滅，熒光猝滅過程遵循Stern-13Volmer方程，見方程（1）：F0+kq0Q1+KsvQ（1）F式中，F(xiàn)0和F分別代表不存在和存在猝滅劑時最大發(fā)射波長處的熒光強度；kq為生物分子猝滅速率常數(shù)；0是無猝滅劑存在時熒光體的熒光壽命，對于生物大分子而言，0108s；Q為猝滅劑濃度；Ksv是Stern-Volmer猝滅常數(shù)。對于靜態(tài)猝滅，可用Lineweaver

10、-Burk雙倒數(shù)函數(shù)關(guān)系式擬合：111+（2）F0FF0KLB·F·0Q式中，KLB是靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)13。對于靜態(tài)猝滅，熒光強度與猝滅劑濃度間存在方程（3）所10描述的關(guān)系，可以用來確定結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合常數(shù)。F0FlglgKb+nlgQ（3）F式中，Kb為結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點數(shù)。物質(zhì)稱為熒光猝滅劑，LOFL對Cas的熒光猝滅光譜詳見圖2（圖中08指依次為08號樣品）。由圖2可以發(fā)現(xiàn)，LOFL是Cas的熒光猝滅劑。固定Cas濃度，不斷提高混合溶液中LOFL的濃度，結(jié)果Cas的熒光有規(guī)律地猝滅。對于LOFL，隨著其濃度升高，在461nm波長處的熒光強度逐漸增強，在394.8

11、nm波長處出現(xiàn)了1個等強度發(fā)射點，提示藥物與蛋白之間形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。3.3猝滅機制的推斷和相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)的計算對于動態(tài)猝滅而言，由于猝滅劑對生物大分子的最大擴散控制的碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·mol1·s1，如果計算1011出的kq值小于2.0×10L·mol·s，表明該猝滅過程是分子擴散和碰撞引起的動態(tài)猝滅。如果計算出的kq值遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol1·s1，則表明該猝滅過程是分子之間形成了基態(tài)復(fù)合物引起的靜態(tài)猝滅。另外，溫度對Ksv值的影響也可以幫助區(qū)分動態(tài)和靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅

12、過程中，當(dāng)溫度升高，分子間碰撞加劇，Ksv值變大；靜態(tài)猝滅過程中，溫度升高，基態(tài)復(fù)合物穩(wěn)定性下降，Ksv值變小12。為了推測熒光猝滅機制，分別在25和302個溫度下測定熒光猝滅情況，從熒光光譜中可以得到F0和F值，以F0/F對Q作圖，得到圖3。根據(jù)圖3中的曲線，應(yīng)用Stern-Volmer方程擬合的參數(shù)見表1。1（/F0F）F0/F25302530024Q/1066mol·L18101/Q/（106L·mol1）33.1結(jié)果與分析熒光光譜分別對0.2g·L1的Cas溶液、0.5×105mol·L1的LOFL溶液、緩沖液在285nm波長處激發(fā)，記

13、錄發(fā)射光譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cas的最大發(fā)射波長在340nm處；LOFL的最大發(fā)射波長為461nm；而緩沖液和LOFL溶液在340nm波長處幾乎未見發(fā)射熒光峰，所以不會對Cas溶液產(chǎn)生的熒光造成干擾，見圖1。900aba.Cas溶液熒光強度圖32種溫度下LOFL與Cas相互作用的Stern-Volmer曲線Fig3Stern-VolmerplotsfortheinteractionbetweenLOFLandCasat2kindsoftemperatures表1圖42種溫度下LOFL與Cas相互作用的Lineweav-er-Burk曲線Fig4Lineweaver-Burkqu-enchingplo

14、tsfortheinterac-tionbetweenLOFLandCasat2kindsoftemperatures1200880LOFL與Cas相互作用的Stern-Volmer常數(shù)和曲線擬合方程Tab1Stern-VolmerquenchingconstantsandcurvesfittedequationofinteractionbetweenLOFLandCas0所以采用靜態(tài)猝滅模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。根據(jù)方程（2）對25和302種溫度下的熒光猝滅數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，擬合曲線見圖4。從圖4中發(fā)現(xiàn)曲線的線性關(guān)系良好，從斜率可以計算得到相應(yīng)溫度下的KLB值，KLB近似于熱力學(xué)結(jié)合常數(shù)K13。結(jié)合K

15、LB值與相關(guān)熱力學(xué)公式（4）、（5），可以計算得到相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)，見表2。中國藥房201122卷第25期熒光強度600線性回歸方程600300r0.99810300350c400450500波長/nm0300400波長/nm500圖13種溶液的熒光光譜Fig1Fluorescencespectraof3kindsofsolutions3.2圖2LOFL對Cas的熒光猝滅光譜Fig2EffectofLOFLonfluorescencespectraofCasLOFL對Cas的熒光猝滅作用蛋白質(zhì)是熒光體，內(nèi)源性熒光主要來自于色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）等氨基酸殘基，在28

16、0nm波長附近激發(fā)，其熒光峰分別位于348、303、282nm波長處，強度比為10，11TrpTyrPhe10090.5。Cas的最大發(fā)射波長在340nm處，所以可以判斷Cas的熒光主要來自于Trp殘基。與熒光物質(zhì)相互作用導(dǎo)致熒光強度下降或者能使熒光量子產(chǎn)率降低的PharmacyVol.22GRTlnK（4）GHTS（5）式中，G為自由能，H為標(biāo)準(zhǔn)焓，S為標(biāo)準(zhǔn)熵，R為氣體常數(shù)，T為絕對溫度。表2LOFL與Cas相互作用的Lineweaver-Burk猝滅常數(shù)、曲線擬合方程和相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)Tab2Lineweaver-BurkquenchingconstantKLB，curvesfittedeq

17、uationandtherelativethermodynamicparametersoftheinteractionbetweenLOFLandCasT/2530線性回歸方程KLB/（×104H/（kJ·G/S/（J·11112.17-39.85-25.14-48.54計算得到相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)。結(jié)果提示二者的相互作用是以氫鍵和范德華力為主，二者以接近11的比例發(fā)生相互作用。參考文獻(xiàn)12345孫曼春，方世平，王智勇，等.鹽酸左氧氟沙星在健康人體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究J.中國藥業(yè)，2010，13（3）：5.裴志強，尹莉芳，周建平.中心復(fù)合設(shè)計法優(yōu)化鹽酸左氧氟沙星緩釋片處方

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19、ensitivemolecularlyimprintednanospheres/hydrogelcompositeasacoatingforimplantablebiosensorsJ.Biomaterials，2010，31（18）：4944.（收稿日期：2010-09-25修回日期：2010-11-23）·2335·113.96×10-81.19×10-3F0-FQ67從表2中可以發(fā)現(xiàn)，KLB值隨著溫度的升高而變小，與KSV值隨溫度的變化是一致的，說明溫度升高后降低了LOFL與Cas之間的相互作用。蛋白質(zhì)與小分子之間的非共價鍵相互作用包括4種類型，分別是范德華力、氫鍵、疏水作用和靜電作14用。G、H和S能夠反映相互作用模式。當(dāng)溫度變化較小時，H可以看作是常數(shù)，H是負(fù)值顯示反應(yīng)是放熱過程；G為負(fù)值表示反應(yīng)是自發(fā)過程。對于典型的疏水作用，H和S0都是正值；當(dāng)焓變和熵變都-0.2是負(fù)值表示主要存在范德華-0.4力以及形成了氫鍵15。測得-0.625LOFL與Cas結(jié)合的H和S30-0.81分別為39.85kJ·mol和-11148.54J·mol