膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)脊髓損傷后功能及前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元酶組織化學(xué)改變的研究

1、    膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)脊髓損傷后功能 及前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元酶組織化學(xué)改變的研究        摘要目的探討膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）對(duì)損傷脊髓運(yùn)動(dòng)功能及前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元酶組織化學(xué)改變的影響。方法改良Allen撞擊致T13脊髓不完全損傷，蛛網(wǎng)膜下腔分別給予生理鹽水和GDNF，不同時(shí)間分別：測(cè)定大鼠后肢神經(jīng)功能；利用酶組織化學(xué)染色方法顯示脊髓側(cè)前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中膽堿酯酶（ChE）和酸性磷酸酶（ACP）活性并通過(guò)計(jì)算機(jī)像分析系統(tǒng)將酶活性量化、比較。結(jié)果神經(jīng)功能隨

2、時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸恢復(fù)，GDNF有助于功能恢復(fù)，但3周時(shí)均未達(dá)正常標(biāo)準(zhǔn)；ChE和ACP活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而向正常趨近，GDNF顯著加強(qiáng)了這一趨勢(shì)；隨著ChE水平上升和ACP水平隆低，大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)，兩者呈現(xiàn)較強(qiáng)的相關(guān)性。結(jié)論前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元酶學(xué)改變與神經(jīng)功能恢復(fù)密切相關(guān)；GDNF加強(qiáng)前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元酶學(xué)改變，呈現(xiàn)對(duì)損傷神經(jīng)元有保護(hù)作用。關(guān)鍵詞膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）；脊髓；創(chuàng)傷與損傷；膽堿酯酶（ChE）；酸性磷酸酶（ACP）；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元Effects of GDNF to Enzyme Histochemical Changes on Anterior Horn Motor Neur

3、ons Following Incomplete Spinal Cord Injury in RatsSong Haital，Jia Lianshun，Chen Zheyu（Department of Orthopedics, Changzheng Hospital, Shanghai 200003）AbstractObjectiveTo investigate effects of GDNF to enzyme histochemical changes on anterior horm motor neurons following incomplete spinal cord injur

4、y in rats. MethodsAnimals were divided into three groups of normal contrast, NS and GDNF were supplied through subarachnoid cavity after T13 segments of spinal cord were injured by modified Allen's crush method, the specimen of spinal cord were taken at different time and sectioned. Enzyme histo

5、chemical technique of ACP and ChE was conducted. The activity of ACP and ChE at front corner motor neuron were quantized and compared applying image analysis of computer. ResultsFollowing incomplete spinal cord injury in rats, (1)Nerve function of lower limbs got gradual recovery as time going on, a

6、nd GDNF enhanced this function progression, but it could not reach normal criteria after 3 weeks;(2)The enzyme activity of ChE and ACP at front corner motor neuron tended to normal standard gradually and GDNF could strengthen obviously this trend;(3)As the level of ChE increasing and ACP decreasing

7、of anterior horn neurons, behind limbs of injuried rats got revovered gradually, and there is strong correlation between the activity of ChE and ACP and rat motor function.Conclusion(1)Enzyme changes of spinal cord front horn motor neuron were correlated closely with motor function restore;(2)GDNF c

8、onsolided this enzyme changes and indicated that GDNF plays a role in protecting the spinal cord motor neuron against injury.Key wordsGlial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF); Spinal cord; Trauma and injury; Cholinesterase; Acid phosphatase; Motor neuron大鼠脊髓不完全損傷后運(yùn)動(dòng)功能可有不同程度恢復(fù)，最近研究表明其恢復(fù)過(guò)程中前角

9、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)膽堿酯酶（ChE）和酸性磷酸酶（ACP）活性變化有一定規(guī)律，并與運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)呈較強(qiáng)的相關(guān)性1。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)特異性最強(qiáng)的多巴胺能神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活起支持作用2。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠改良Allen's脊髓損傷模型，觀察外源性GDNF對(duì)大鼠損傷脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元ChE及ACP活性動(dòng)態(tài)變化的影響，并結(jié)合大鼠雙下肢運(yùn)動(dòng)功能變化，以探討GDNF對(duì)損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有否保護(hù)作用。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組SD雄性大鼠54只，200250g，隨

10、機(jī)分成3組：（1）對(duì)照組6只，僅作椎板打開(kāi)，不損傷脊髓；（2）生理鹽水（NS）組24只，脊髓損傷后經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔微量注射器注入NS201；（3）GDNF組24只，同樣經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔給予GDNF201（GDNF）純度為1g/1，由第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物研究所陳哲宇博士惠贈(zèng)3）。NS組及 GDNF 組均分為1 d及1、2、3周四個(gè)時(shí)段組。1.2改良Allen's脊髓損傷模型的建立40.3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔麻醉，大鼠俯臥位固定于江灣I型立體定向儀上，手術(shù)暴露T12、T13、L1脊髓節(jié)段，以T13脊髓為損傷區(qū)，以脊髓后正中血管為中心，用自制的改良Allen裝置致傷脊髓（致傷力為10g

11、×7.5 cm）。掌握撞擊成功的標(biāo)志為：大鼠尾巴痙攣性擺動(dòng)，雙下肢及軀體回縮樣撲動(dòng)，雙下肢呈馳緩性癱瘓。微量注射器抽取NS，在損傷區(qū)上下兩端分別向蛛網(wǎng)膜下腔注射各緩慢注射101，注射時(shí)間不短于10 min。GDNF組同樣注射GDNF201。各組術(shù)畢均肌肉注射舒氨新10mg，動(dòng)物麻醉復(fù)蘇后溫室隔離喂養(yǎng)，每2 d擠壓或穿刺排尿一次，直至處死。1.3神經(jīng)功能評(píng)定分別于脊髓損傷后1 d及1、2、3周測(cè)定每組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能。采用改良Rivlin法5，將大鼠身體軸線與斜板縱軸垂直放置，斜板每次升高5°，以大鼠能夠停留5秒鐘的最大角度為其功能值。1.4酶組織化學(xué)染色分別于神經(jīng)功能評(píng)定后

12、處死動(dòng)物：1%戊巴比妥鈉致死劑量腹腔麻醉，4%多聚甲醛、苦味酸混合液（4）經(jīng)左心室灌注固定，脊髓標(biāo)本后固定12 h，置于20%蔗糖PBS緩沖液中待其自然下沉。標(biāo)本冰凍連續(xù)切片（厚25m），每切5片取2片，分別行Waters-Butcher法染色顯示ACP，Karnovsky-Roots法染色顯示ChE，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片6。表1大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間斜板實(shí)驗(yàn)（爬坡平均角度，±S）傷后時(shí)間對(duì)照組NS組GDNF組1天73.33±2.2235.00±3.3334.17±2.781周74.17±2.7845.50±2.50

13、53.50±2.502周75.00±2.5049.67±2.7862.40±4.163周74.40±4.1651.17±4.1669.67±3.33注：GDNF組與NS組比較P<0.01，P>0.05；GDNF組與對(duì)照比較P<0.01，P>0.05；NS組與對(duì)照組比較均P<0.01。 1.5像分析及數(shù)據(jù)處理切片經(jīng)光鏡檢查照像及顯微像分析系統(tǒng)（上海復(fù)日生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究所研制Smartscap 2000像采取卡和Petium主機(jī)組成）處理，每組取10片測(cè)量脊髓前外側(cè)核和后外側(cè)核陽(yáng)性顆粒的平均灰度（積

14、分灰度值占面積的百分率，Mean Gray, MG)及陽(yáng)性顆粒等效圓直徑（Diameter of Equivalent circle ,ED),結(jié)果以X±S表示，用t檢驗(yàn)比較各組標(biāo)本差異的顯著性。2結(jié)果2.1神經(jīng)功能變化大鼠雙下肢運(yùn)動(dòng)功能對(duì)照組無(wú)變化，NS組及GDNF組傷后立即出現(xiàn)明顯障礙，隨時(shí)間延續(xù)呈逐漸恢復(fù)趨勢(shì)，但GDNF組恢復(fù)明顯好于NS組，并在3周接近對(duì)照組（P>0.05）。2.2損傷區(qū)ChE活性變化正常大鼠脊髓前角大、中型神經(jīng)元ChE活性反應(yīng)強(qiáng)烈，細(xì)胞輪廓清晰，核不著色，神經(jīng)元酶陽(yáng)性反應(yīng)顆粒呈紅褐色（1）。NS組術(shù)后7 d脊髓前角外側(cè)核大、中型神經(jīng)元ChE活性最低：染

15、色與正常側(cè)相比明顯變淡（表現(xiàn)為MG值降低），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少（表現(xiàn)為ED值降低），核仁偏位，輪廊不清（2）；術(shù)后14 d ChE活性上升，陽(yáng)性細(xì)胞增加，染色仍淡；術(shù)后21 d ChE活性最高，但未達(dá)正常值，陽(yáng)性細(xì)胞仍少，染色仍明顯淡于正常組。GDNF組術(shù)后7 d ChE活性降低之后開(kāi)始升高，14 d 時(shí)染色淡于正常，細(xì)胞輪廊較清晰；21 d CHE活性接近正常（與對(duì)照組比較MG值P<0.01，但ED值P>0.05），陽(yáng)性細(xì)胞染色趨向正常，細(xì)胞形態(tài)正常，輪廓清晰。經(jīng)比較，術(shù)后7至21d GDNF組ChE含量大于NS組（表2）。1大鼠正常脊髓ChE染色Karnovsky-Roots法，

16、×1002大鼠脊髓損傷后7d ChE染色Karnovsky-Roots法，×1002.3損傷區(qū)ACP活性變化正常脊髓前角大、中型神經(jīng)元酶陽(yáng)性反應(yīng)顆粒細(xì)小，均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中，呈淺棕色，細(xì)胞核及核仁清晰可見(jiàn)（3）。NS組損傷后7 d脊髓前角大、中型神經(jīng)元酶陽(yáng)性反應(yīng)顆粒ACP活性明顯升高（表現(xiàn)為MG、ED值增加）：反應(yīng)顆粒呈深棕黑色，細(xì)胞數(shù)量減少，核偏位（4）；術(shù)后14 d酶反應(yīng)緩解，細(xì)胞數(shù)量仍少，酶反應(yīng)呈較深棕色；21 d時(shí)神經(jīng)元染色呈棕色，ACP活性仍高于對(duì)照組。GDNF組術(shù)后7 d ACP活性升高，前角大、中型神經(jīng)元酶陽(yáng)性反應(yīng)顆粒呈深棕紅色，細(xì)胞數(shù)量略減少；術(shù)后14 d酶

17、反應(yīng)緩解，酶反應(yīng)呈棕色，術(shù)后21 d呈較淺棕色，ACP活性基本達(dá)到正常水平。經(jīng)比較術(shù)后7至21 d GDNF組脊髓前角ACP陽(yáng)性反應(yīng)顆粒的MG和ED值明顯低于NS組，說(shuō)明ACP反應(yīng)GDNF組明顯弱于NS組（表3）。3正常脊髓ACP染色Waters-Butcher法，×1004脊髓損傷后7d Acp染色Waters-Butcher法，×100表2術(shù)后不同時(shí)間脊髓側(cè)前角神經(jīng)元ChE陽(yáng)性顆粒MG和ED變化（像分析采用的二分割值為84）術(shù)后時(shí)間MGED（天）NSGDNFP值NSGDNFP值721.12±2.0425.97±1.02<0.0118.47

18、77;4.4223.45±4.29>0.051424.45±1.2328.25±1.36<0.0118.10±1.8421.70±4.45<0.012125.52±1.4330.11±1.52<0.0119.54±3.4124.29±4.07<0.05注：正常對(duì)照組MG為32.43±0.49，ED為26.44±6.71。 表3術(shù)后不同時(shí)間脊髓側(cè)前角神經(jīng)元ACP陽(yáng)性顆粒MG和ED變化術(shù)后時(shí)間MGED（天）NSGDNFP值NSGDNFP值743.27±

19、;1.4041.03±1.53<0.0535.97±4.9922.03±5.71<0.051442.60±1.5940.25±1.30<0.0529.97±5.8423.76±6.11<0.052140.03±1.8238.76±1.67>0.0528.16±5.7322.13±5.34<0.05注：正常對(duì)照組MG為36.84±1.13，ED為20.31±2.64 3討論3.1GDNF對(duì)脊髓損傷后功能的影響脊髓不完全損傷后呈現(xiàn)暫時(shí)

20、性截癱，隨時(shí)間推移根據(jù)致傷量大小的不同，運(yùn)動(dòng)功能不同程度恢復(fù)。朱悅等報(bào)道脊髓不完全損傷（10g×5 cm）后4周大鼠運(yùn)動(dòng)功能基本恢復(fù)正常8。本實(shí)驗(yàn)10g×7.5 cm致傷力下脊髓立即出現(xiàn)功能障礙，隨時(shí)間推移NS組運(yùn)動(dòng)功能呈逐漸恢復(fù)趨勢(shì)，但3周時(shí)仍明顯差于對(duì)照組；GDNF能夠有效改善大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能，在第2、3周均明顯優(yōu)于NS組，而且在損傷后3周恢復(fù)接近對(duì)照組。3.2ACP和ChE活性變化反映脊髓神經(jīng)元損傷程度脊髓損傷后部分神經(jīng)元因挫傷嚴(yán)重而死亡，斷而消失；部分存活者呈現(xiàn)不同程度的退行性變：胞核偏位、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)解聚、溶酶體增多及一些酶的活性發(fā)生變化。ChE主要定位于粗面

21、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)完整和功能活性密切相關(guān)，它包括乙酰膽堿酯酶（AchE)和丁酰膽堿酯酶（BuChE)7,它的活性間接代表著對(duì)ChE的滅活作用，因而其在膽堿能神經(jīng)元中的含量與乙酰膽堿的合成呈平行關(guān)系。脊髓損傷后神經(jīng)元中ChE活性減弱提示粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少及AchE含量減低、膽堿能神經(jīng)的功能減弱。ACP是細(xì)胞內(nèi)溶酶體的標(biāo)記酶，其活性高低代表著溶酶體膜滲透性的高低；脊髓損傷后神經(jīng)元中ACP活性增加表明溶酶體數(shù)量增加和功能活躍、膜滲透性增高，多種酶釋放增加促進(jìn)細(xì)胞器分解，使神經(jīng)細(xì)胞受損甚至死亡。因而，損傷神經(jīng)元中ACP和ChE的活性反映了細(xì)胞損傷及退變程度。3.3GDNF對(duì)損傷脊髓前角運(yùn)動(dòng)

22、神經(jīng)元酶活性變化的影響脊髓損傷后側(cè)前角大、中型神經(jīng)元內(nèi)ACP和ChE活性的變化過(guò)程及反應(yīng)強(qiáng)度從酶學(xué)角度反映了神經(jīng)元細(xì)胞受損傷的程度及其轉(zhuǎn)歸過(guò)程。本研究表明脊髓不完全損傷后1周前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)ChE活性明顯減弱，并隨時(shí)間的延續(xù)而呈上升趨勢(shì)；ACP活性明顯增強(qiáng)，隨時(shí)間延續(xù)而減弱，但3周時(shí)ChE及ACP活性距正常水平仍有較大差距。GDNF能有效抑制前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)ChE活性的減弱和ACP活性的增強(qiáng)，其作用隨時(shí)間延續(xù)而得到加強(qiáng)，2周時(shí)作用最強(qiáng)，3周時(shí)ChE及ACP活性接近正常水平，體現(xiàn)了GDNF對(duì)損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。3.4損傷脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元酶活性變化與神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)系Nakamura1最

23、近研究表明大鼠頸髓不完全損傷后前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活性變化與運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)具有較強(qiáng)的相關(guān)性，從而闡明脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在脊髓運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)中所起的作用。本組結(jié)果表明大鼠脊髓損傷后ChE活性降低及ACP活性上升，并隨時(shí)間推移而逐漸向正常水平接近，GDNF能有效促進(jìn)這一過(guò)程，表現(xiàn)在GDNF比NS更明顯增加ChE活性和減弱ACP活性；大鼠脊髓不完全損傷后雙下肢運(yùn)動(dòng)功能障礙，傷后1 d最重，隨時(shí)間推移運(yùn)動(dòng)功能逐漸出現(xiàn)恢復(fù)，GDNF組后肢功能恢復(fù)明顯優(yōu)于NS組，但仍未達(dá)到正常水平。結(jié)果提示，隨著損傷脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元酶水平向正常接近，大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)，兩者呈現(xiàn)較強(qiáng)的相關(guān)性。這一

24、結(jié)果還表明脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在脊髓不完全損傷運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)中起重要作用。3.5GDNF對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的作用及對(duì)可能機(jī)制GDNF為一種多效能的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，最早（Lin,1993）2發(fā)現(xiàn)GDNF的功能是使體外培養(yǎng)的鼠胚中腦腹側(cè)多巴胺（DA）能神經(jīng)元存活延長(zhǎng)。近幾年研究證實(shí)GDNF對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元也有明顯的助存活、促分化及增強(qiáng)代謝的功能9；一些實(shí)驗(yàn)還表明GDNF對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有顯著的修復(fù)功能：切斷新生鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，可使脊髓中40%50%相應(yīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡，存活者也呈現(xiàn)萎縮；在斷端加入GDNF則可有效阻止神經(jīng)元死亡和萎縮，存活神經(jīng)元胞體還有一定程度增大10。目前關(guān)于NTF對(duì)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)的主要機(jī)制有（1）維持

25、細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)定；（2）減少自由基的損傷；（3）延緩細(xì)胞凋亡；（4）促進(jìn)細(xì)胞功能恢復(fù)11。我們的另一項(xiàng)研究表明，GDNF在繼發(fā)性脊髓損傷過(guò)程中可能通過(guò)減少神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+積聚、緩解組織腫脹、減輕脊髓組織缺血性損傷，對(duì)脊髓損傷起保護(hù)作用（另文發(fā)表）。因而，進(jìn)一步探討GDNF作用機(jī)理，對(duì)了解神經(jīng)元發(fā)育及損傷機(jī)制具有十分重要的意義。本工作受國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究規(guī)劃：腦功能和腦重大疾病的基礎(chǔ)研究項(xiàng)目資助(基金編號(hào)G1999054000)宋海濤（第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院上海市200003）賈連順（第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院上海市200003）陳哲宇（第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部神經(jīng)生物教研室）路長(zhǎng)林（第二軍醫(yī)大學(xué)基

26、礎(chǔ)部神經(jīng)生物教研室）參考文獻(xiàn)1，Nakamura M, Fujimura Y, Yato Y, et al. Changes in choline acetyltransferase activity and distribution following incomplete cervical spinal cord injury in the rat. Neuroscience, 1996,75:4812，Lin HL, Doherty DH, Lile DJ, et al. GDNF: A glial cell-line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons.Science,1993,260:1130323，陳哲宇，何成