糖尿病腦缺血再灌注大鼠海馬膠質(zhì)細(xì)胞凋亡研究

1、糖尿病腦缺血再灌注大鼠海馬膠質(zhì)細(xì)胞凋亡研究         11-03-14 13:36:00     編輯：studa20                  作者：李俊君 羅濤 景麗 馬軼 郭風(fēng)英 張建中【摘要】  目的 探討糖尿病腦缺血再灌注時神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷加重的分子機(jī)制。方法 96只成年SD

2、大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)對照組、正常血糖腦缺血組、糖尿病腦缺血組、PD98059預(yù)防糖尿病腦缺血組，每組24只。采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病，雙血管閉塞聯(lián)合放血法建立糖尿病大鼠全腦缺血模型，運(yùn)用HE染色、TUNEL方法，研究高血糖狀態(tài)下腦缺血再灌注時和使用P-ERK1/2阻斷劑PD98059后海馬CA4、CA2神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡表達(dá)狀況。結(jié)果 糖尿病大鼠全腦缺血再灌注時，海馬CA4、CA2區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在缺血15min，再灌注1、3h凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，高于正常血糖腦缺血組大鼠(P<0.05)，使用P-ERK1/2阻斷劑PD98059后，在缺血再灌注各時間點(diǎn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡細(xì)胞表達(dá)減少，低于

3、糖尿病腦缺血組(P<0.05)。結(jié)論 高血糖加重腦缺血再灌注時神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，高血糖誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化可能介導(dǎo)了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。 【關(guān)鍵詞】  腦缺血;再灌注;糖尿病;高血糖;神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2;大鼠實(shí)驗研究證明 ，高血糖能夠加重缺血再灌注時腦組織的損傷1。缺血性腦組織損傷主要表現(xiàn)為兩種形式，即缺血性壞死和凋亡，而凋亡是缺血腦區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要形式2。神經(jīng)細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制尚不清楚，近年來發(fā)現(xiàn)MAPK家族成員細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有不可替代的重要作用3，目前研究多集中在神經(jīng)元上，研究顯示糖尿病腦缺血再灌注時，

4、神經(jīng)元損傷加重，神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，MAPK家族成員ERK1/2在神經(jīng)元表達(dá)上調(diào)。但是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的另一大類細(xì)胞-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在糖尿病腦缺血再灌注時損傷的形式、損傷的程度及其機(jī)制尚不清楚。本研究采用糖尿病大鼠雙血管阻塞聯(lián)合放血法建立高血糖腦缺血再灌注模型，對比觀察缺血15min，再灌注1、3、6h海馬區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡及其與MAPK家族成員ERK1/2激活的關(guān)系。1 材料與方法1.1 材料健康成年SD大鼠，體重250300g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位切口末端標(biāo)記(TdTmediated dUTP nickend labeling，TUNEL)

5、試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ) 、PD98059購自上海MERCK化工技術(shù)有限公司。1.2 方法1.3 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 12.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有計量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 組織形態(tài)學(xué)改變 Sham組各時間點(diǎn)海馬CA2、CA4區(qū)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)基本正常(圖1，見封2)。NCI組在缺血15min神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)基本正常，小血管周圍出現(xiàn)輕度水腫，缺血再灌注1h，小血管周圍水腫加重，與此同時神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞

6、周圍逐漸出現(xiàn)水腫，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞核輕度腫脹，隨時間推移，核周水腫及核腫脹逐漸加重;缺血3h神經(jīng)元核漸出現(xiàn)核腫脹，隨時間推移，核腫脹逐漸加重(圖2，見封2)。DCI組在缺血15min小血管、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞周圍均出現(xiàn)水腫，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元核腫脹，隨時間推移核周水腫及核腫脹逐漸加重，缺血再灌注1h出現(xiàn)少量神經(jīng)元壞死，3h壞死神經(jīng)元增加，局部出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生，6h壞死神經(jīng)元周圍也出現(xiàn)水腫，小血管、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞周圍水腫明顯(圖3，見封2)，局部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞灶性聚集增生。PD組缺血15min小血管、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞周圍存在水腫，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元核略腫脹，隨時間推移，水腫逐漸減輕，缺血再灌注6 h，

7、小血管周圍有輕度水腫(圖4，見封2)，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)基本正常。2.2 TUNEL染色結(jié)果 Sham組海馬CA2、CA4區(qū)未見明顯凋亡神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。NCI組海馬CA2、CA4區(qū)在缺血再灌注1、3、6h出現(xiàn)了凋亡神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增多，于再灌注1、3、6h凋亡神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生率高于Sham組(P<0.05)。DCI組海馬CA2、CA4區(qū)在缺血15min，再灌注1、3、6h各時間點(diǎn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡發(fā)生率均明顯高于NCI組(P<0.05)。PD組在缺血再灌注各時間點(diǎn)海馬CA2、CA4區(qū)凋亡神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少，凋亡神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)明顯低于DCI組(P<0.05)。參見表1、2及圖58(見封2)。表1 大鼠海馬CA4區(qū)凋亡神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞統(tǒng)計結(jié)果(±s,個/0.01mm2)表2 大鼠海馬CA2區(qū)凋亡神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞統(tǒng)計結(jié)果(±s,個/0.01mm2)3 討論Li PA4等在動物腦缺血再灌注實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)高血糖可加重缺血及再灌注后的腦損傷，本課題既往相關(guān)實(shí)驗也證實(shí)5，糖尿病腦缺血再灌注時，神經(jīng)元凋亡增多，高血糖能夠加重腦缺血再灌注時神經(jīng)元的損傷。本研究組織形態(tài)學(xué)觀察顯示，糖尿病腦缺血組海馬CA4、CA2區(qū)水腫明顯重于其它組別，不同時間點(diǎn)水腫先開始于小血管，再波及到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，最后影響到神經(jīng)元，不同時間點(diǎn)的病變部位和病理改變均具有一定的規(guī)律性。糖尿病大