硅膠_環(huán)糊精固定金屬離子親合吸附劑的制備及性能

1、第17卷第2期化學(xué)研究Vol.17No.2 2006年6月CHE M I CALRESE ARCH Jun.2006硅膠2環(huán)糊精固定金屬離子親合吸附劑的制備及性能葉青1,張世秀2,段天寶1,葉文玉13(1.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,河南開(kāi)封475001;2.河南省醫(yī)藥學(xué)校,河南開(kāi)封475001摘要:以硅膠鍵合2環(huán)糊精(2CD為載體,亞氨基二乙酸(I D A為螯合基,制備了新型固定金屬離子親合吸附劑.通過(guò)13C固體核磁、元素分析對(duì)其進(jìn)行了表征.每克吸附劑分別含I D A分子158mol,2C D分子136mol.研究了吸附劑對(duì)2淀粉酶的吸附特性.關(guān)鍵詞:親合吸附劑;硅膠;2環(huán)糊精;2淀粉酶中圖分類號(hào)

2、:O647.33文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1008-1011(200602-0053-04Preparati on and Properti es of I mmobili zed M et al I on Affi n ityAdsorbent Based on Sili ca Gel2Cyclodextr i nYE Q ing1,ZHANG Shi2xiu2,DUAN Tian2bao1,YE W en2yu13(1.College of Che m istry and Che m ical Engineering,Henan U niversity,Kaifeng475001,Henan

3、,China;2.Phar m aceutical School of Henan Province,Kaifeng475001,Henan,ChinaAbstract:A ne w i m mobilized metal affinity(I M Aads orbent was p repared by2cycl odextrin(2CDbonded silica gel with i m inodiacetic acid(I D Aas ligand.The p repared ads orbent was characterizedby s olid state13C CP/MAS NM

4、R and elemental analysis.The I D A and CD contents in the ads orbentwere deter m ined t o be158mol/g and136mol/g,res pectively.The ads or p ti on capability of the ad2s orbent t o2a mylase was als o studied.Keywords:affinity ads orbent;silica gel;2cycl odextrin;2a mylase固定金屬離子親合吸附劑(I M A由載體、螯合基和金屬離子

5、三部分組成,利用材料上固定的金屬離子與蛋白質(zhì)表面的組氨酸殘基配位結(jié)合,選擇性地吸附蛋白質(zhì),在蛋白質(zhì)固定和分離方面有廣泛應(yīng)用1,2.載體的物理化學(xué)性質(zhì)顯著影響著吸附效果,多糖類軟基質(zhì)載體,生物相容性好,吸附量大,但機(jī)械強(qiáng)度小,穩(wěn)定性差,難以用于加壓體系3,4;無(wú)機(jī)硅膠類載體,機(jī)械強(qiáng)度高,但耐堿性差,吸附量小,硅羥基非特異吸附強(qiáng)5.在硅膠表面鍵合有機(jī)層,鈍化硅羥基,創(chuàng)造溫和的接觸表面,有望制備一種兼具高吸附量和高機(jī)械性能的吸附劑.Xi6等將殼聚糖涂敷于硅膠表面制備了新型I M A材料,顯示了對(duì)胰島素的強(qiáng)吸附.環(huán)糊精與蛋白質(zhì)的作用已有廣泛研究7.蛋白質(zhì)表面的氨基酸能部分嵌入環(huán)糊精空腔中,產(chǎn)生弱的包合

6、作用,減弱氧氣,溶劑分子的作用,有利于保持蛋白質(zhì)的活性.環(huán)糊精分子易于進(jìn)行多種衍生化8,9,衍生化硅膠2環(huán)糊精填料已被應(yīng)用于高效液相色譜中10,但作為I M A載體還未見(jiàn)報(bào)道.作者首次制備了硅膠2環(huán)糊精為載體的固定金屬離子吸附劑,選用2淀粉酶為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,考察了吸附劑的吸附性能.1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器和試劑I nfinity p lus300WB型固體核磁共振儀(天津大學(xué)分析測(cè)試中心,觀測(cè)頻率為75MHz;PE22400型元素收稿日期:2006-01-11.基金項(xiàng)目:河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(0424270066.作者簡(jiǎn)介:葉青(1979-,男,碩士,從事高分子功能材料性能研究.3通訊聯(lián)系人,Email

7、:hdye wenyu.54化學(xué)研究2006年分析儀;Shi m adzu UV 2250型紫外2可見(jiàn)分光光度計(jì).國(guó)產(chǎn)721型分光光度計(jì).Z CX 23硅膠(粒徑4575m ,比表面積200300m 2/g,孔徑812nm ,青島海洋化工廠,使用前在稀鹽酸中活化5h,用水洗至中性,真空干燥備用;2環(huán)糊精(2CD ,上?；瘜W(xué)試劑公司,使用前重結(jié)晶,真空干燥48h;2氯丙基三乙氧基硅烷(武漢大學(xué)化工廠,使用前重蒸;N ,N 2二甲基甲酰胺(DMF 使用前用無(wú)水硫酸鎂和分子篩干燥,蒸餾收集145餾分,密封待用;2淀粉酶(Sig ma 公司,其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?酶溶液的蛋白質(zhì)濃度用紫外光譜吸收

8、差法11測(cè)定:c =1.45×A 280-0.74×A 260(1c 為濾液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度(g /L ,A 280,A 260為蛋白溶液在280nm 和260nm 的吸光度值.1.2吸附劑的制備Si O 22CD 載體的制備:活化硅膠20g 分散于300mL 無(wú)水甲苯中,加入8mL 2氯丙基三乙氧基硅烷,氮?dú)獗Ｗo(hù)下110反應(yīng)8h 后降至室溫,固體產(chǎn)物(Si O 22Cl 抽濾,依次用DMF 、甲苯、水洗滌,真空干燥48h 備用.取5g 干燥的2CD 溶于50mL 無(wú)水DMF 中,加入0.5g NaH 反應(yīng)0.5h,濾去不溶物,濾液中加入Si O 22Cl 再緩慢升溫至9

9、0反應(yīng)24h,產(chǎn)物(CD 2Si O 2抽濾,固體依次用DMF 、水洗滌,真空干燥48h 備用.固體中2CD 的含量用分光光度法測(cè)定12.I D A 螯合基的連接:取上述Si O 22CD 載體20g 分散于pH 值為9的碳酸鈉溶液中,緩慢滴加10mL 環(huán)氧氯丙烷,50活化12h,產(chǎn)物過(guò)濾,固體立即轉(zhuǎn)入pH 值為11的氫氧化鈉溶液(含30%二氧六環(huán)中,再加入3g 亞氨基二乙酸,1mg 硼氫化鈉,70反應(yīng)24h,產(chǎn)物用去離子水浸泡24h,再用乙醇、水各洗3次,除去未鍵合的小分子,真空干燥48h,得白色固體粉末(I D A 2CD 2Si O 2.吸附劑的制備路線見(jiàn)圖1. 圖1吸附劑的制備路線Fi

10、g .1The p reparati on r oute of the ads orbent1.3淀粉酶吸附實(shí)驗(yàn)在4支5mL 試管中分別加入50mg 固定Cu 2+,N i 2+,Zn 2+,Co 2+四種金屬離子的吸附劑,再加入1mL 1g/L 的淀粉酶的磷酸鹽緩沖溶液,充分震蕩1h,離心,測(cè)定上層清液中剩余蛋白的濃度.吸附劑對(duì)2淀粉酶的吸附效果,以吸附率表示,其定義如(2式:R =(A o -A e /A o ×100%(2其中R 為2淀粉酶的吸附率,A o ,A e 分別為溶液中的初始蛋白含量和吸附平衡時(shí)上清液的游離蛋白含量,單位g .另取8支試管,分別加入100mg 固定Cu

11、 2+的吸附劑,再加入1mL 不同濃度的2淀粉酶的磷酸鹽緩沖溶液,25恒溫振蕩1h,離心,測(cè)定上層清液蛋白質(zhì)濃度,根據(jù)物料平衡繪制吸附等溫線.第2期葉青等:硅膠2環(huán)糊精固定金屬離子親合吸附劑的制備及性能552結(jié)果與討論2.1吸附劑的制備與表征首先用2CD 、硅烷偶聯(lián)劑與活化硅膠作用,在硅膠表面上錨接2CD 分子,然后對(duì)CD 上未反應(yīng)的羥基進(jìn)行環(huán)氧活化,鍵合能與金屬配位的螯合基,常用的螯合基有亞氨基二乙酸(I D A 、三羥基乙二胺(TE D 、乙二胺二乙酸(EDDA 等1,這些多齒配體分子中配位原子數(shù)小于金屬離子的配位數(shù),固定Cu 2+,Zn 2+,N i 2+,Co 2+表1C D 2Si

12、O 2和I D A 2C D 2Si O 2的元素分析數(shù)據(jù)表Table 1The ele mental analyses of the matrix (C D 2Si O 2and ligand coup led matrix (I D A 2CD 2Si O 2Ads orbentw (C (%w (H (%w (N (%I D A density (mol/g 2CD density 3(mol/g C D 2Si O 23The 2CD a mounts were deter m ined by s pectr ophot ometry methods在I D A 2CD 2Si O 2

13、的固體核磁碳譜中,60105處出現(xiàn)環(huán)糊精結(jié)構(gòu)單元中C1C6的碳峰,證明2CD 分子的筒狀結(jié)構(gòu)在修飾過(guò)程中未受破壞,高場(chǎng)1035處出現(xiàn)的寬峰,對(duì)應(yīng)于硅烷偶聯(lián)劑碳橋上的亞甲基,低場(chǎng)175處出現(xiàn)羰基碳的峰,同時(shí)55,48處出現(xiàn)與氮原子相連的多個(gè)亞甲基峰證明成功引入了I D A 螯合基. 圖2I D A 2C D 2Si O 2的13C 固體核磁圖譜Fig .213C CP /MAS NMR s pectra of ID A 2C D 2Si O 22.2金屬離子的影響圖3I D A 2C D 2Si O 2固定不同金屬離子后對(duì)2淀粉酶的吸附效果Fig .3Ads or p ti on efficie

14、ncy of I D A 2CD 2Si O 2i m mobilized with different metal i ons t o 2a mylase在相同條件下考察了I D A 2CD 2Si O 2分別固定四種二價(jià)金屬離子后對(duì)2淀粉酶的吸附能力,如圖3所示,固定銅離子的吸附劑吸附能力最強(qiáng),平衡時(shí)90%以上的2淀粉酶被吸附.蛋白質(zhì)與金屬的配合是通過(guò)蛋白質(zhì)表面的組氨酸殘基氮原子上的孤對(duì)電子與金屬離子上的空雜化軌道結(jié)合形成的,常用的幾種金屬離子Cu 2+,N i 2+,Zn 2+和Co 2+具有相同電荷,與2淀粉酶形成的絡(luò)合物穩(wěn)定性呈現(xiàn)出Cu 2+>N i 2+>Zn 2+&g

15、t;Co 2+的排列次序,和四種金屬離子的半徑大小次序相反,而金屬離子半徑越小配位作用越強(qiáng).2.32淀粉酶的等溫吸附通過(guò)研究在25時(shí)Cu 2+2I D A 2CD 2Si O 2在不同濃度淀粉酶溶液中的吸附性能,得到如圖4所示的吸附等溫線.從圖4中可56化學(xué)研究2006年以看出,蛋白質(zhì)濃度較低時(shí),吸附量隨濃度增加迅速上升;隨著溶液中蛋白質(zhì)濃度的升高,吸附量增加變緩,并趨向于達(dá)到最大吸附值19.5mg/g.同時(shí)在圖中還可以看到CD2Si O2載體在所有酶濃度下均未呈現(xiàn)出對(duì)2淀粉酶的有效吸附,這說(shuō)明2淀粉酶的吸附是由酶和固定的銅離子配位而產(chǎn)生的特異吸附.對(duì)圖4數(shù)據(jù)使用Lang muir方程進(jìn)行擬合

16、,如(3式:c3/q=c3/q m+1/q m(3其中c3為吸附平衡時(shí)溶液中的蛋白質(zhì)濃度,g/L;q和qm分別為平衡吸附量和最大吸附量,mg/g.以c3/q對(duì)c3作圖,可得圖5所示擬合直線,線性相關(guān)系數(shù)為0.995,通過(guò)直線斜率和截距得到吸附等溫方程,最大吸附量qm為20.8mg/g,與實(shí)驗(yàn)結(jié)果19.5mg/g相近,說(shuō)明吸附過(guò)程屬于Lang muir吸附. 圖425時(shí)2淀粉酶的等溫吸附線Fig.4Ads or p ti on is other m of2a mylase at25圖52淀粉酶等溫吸附Lang muir擬合直線Fig.5Ads or p ti on is other m of2a

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18、vinyli m idazolematrix via ads or p ti onJ.React Funct Polym,2005,62:61-68.3Zachari ou M,Hearn M T W.Ads or p ti on and selectivity characteristics of several hu man serum p r oteins with i m mobilised hardLe wis metal i onchelate ads orbentsJ.J Chro m atogr A,2000,890:95-116.4L iao Y C,Syu M J.Nove

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